沙冬青ErbB3结合蛋白基因转化杏的研究

【摘要】中国杏种资源丰富分布广泛，由于北方春季有低温和晚霜，容易使杏花、幼果受冻，产量和经济效益受到极大损失，因此选育高抗寒杏具有重要的意义。传统的植物育种方法在改善植物耐寒性方面取得的成功非常有限，利用传统方法选育抗寒杏，育种周期长，且抗寒效果不显著，且杏树的抗寒研究多集中在抗寒生理方面。利用现代生物学技术对杏进行抗寒性选育，更具高效性和针对性，可以加速高寒杏新种质的选育进程。植物低温条件下，体内蛋白质的合成与其抗寒性密切相关。沙冬青ErbB3结合蛋白基因（AmEBP1）是沙冬青(AmmopiptanthusmongolicusChengf．)中与低温胁迫相关的基因，低温条件下，能够抑制植物细胞翻译因子（eIF2a）的磷酸化，调控eIF2a的活性，保证蛋白质的正常合成，从而提高植物抗寒能力。本研究以沙冬青总RNA反转录所得cDNA第一条链为模板克隆了AmEBP1基因编码区序列，通过酶切和连接反应构建载体并转化到杏幼胚中，经幼胚培养获得转基因植株，并对转基因植株的耐寒性能进行了研究，为培育抗寒杏新种质打下了基础。主要研究如下：1）以沙冬青总RNA为模板，RT-PCR方法克隆得到目的基因AmEBP1，PCR与测序结果表明，与GeneBank公布的AmEBP1的cDNA（DQ519359）序列长度一致;2）构建原核表达载体pET-22b-AmEBP1转化大肠杆菌，0℃时转化AmEBP1的大肠杆菌存活率是转化空载体的3倍，可以看出，表达了AmEBP1的大肠杆菌具有明显较强的抗寒性；3）大果、岱玉等6个早熟杏品种，不完全花比率差异显著，其中以大果杏不完全花比率最低，仅为11.62%，红荷包最高，高达80.91%，岱玉50.08%，金太阳27.22%，新世纪25.43％；座果率大果杏最高可达29.34％，其次是金太阳，岱玉坐果为7.23%，最低的为红荷包；4）以大果杏花期后30d幼胚为材料，建立了杏幼胚培养体系。WPM培养基作为大果杏的基本培养基，蔗糖10g·L-1，琼脂8g·L-1，pH调至5.8；幼胚诱导芽丛的培养基选择WPM+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1；芽团生根培养基宜选择WPM+NAA0.1mg·L-1+6-BA0.8mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培养基；5）构建植物表达载体pCAMBIA2300-AmEBP1，利用花粉管通道与基因枪结合方法转化大果杏，转化后的幼胚材料先接种WPM+Kan50mg·L-1筛选后，转移到WPM+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1培养基上诱导分化扩繁，再将扩繁材料转移到生根培养基上培养成苗；6）将WPM+Kan50mg·L-1筛选后的材料进行PCR检测，得到6个阳性植株；进一步Southern检测得出此6株系分别出现1-3条杂交带，Southern结果说明AmEBP1基因已经整合到这6个株系的基因组DNA中；将单拷贝转基因株系1、6进行RT-PCR结果显示AmEBP1基因在转录水平上表达；且多带扩繁后目的基因能稳定存在芽切苗中；7）将转基因阳性株系1、6在分化培养基上诱导芽丛，再将芽丛切成带个芽的芽团PCR检测，剔除阴性，继续分化诱导到一定基数，在诱导生根成苗，进行下一步抗寒试验。抗寒试验结果显示：相同低温（-4和-8℃）条件下，转基因植株均比对照表现出较高的成活率；随着处理温度的降低，转基因株系REC与MDA含量始终低于对照植株，但可溶性蛋白含量明显高于对照；转基因植株的低温半致死温度（LT50）比未转基因对照低2.13℃；抗寒试验的其他酶活、可溶性物质的含量结果也说明，转AmEBP1大果杏有较强的抗寒性（比对照）。8）转基因大果杏根际土与周生植物总DNA中未发现目标基因；转基因株系和非转基因株系的土壤微生物优势菌群种类相同，数量无显著差异。
【作者】牛庆霖；
【导师】曹帮华；冯殿齐；
【作者基本信息】山东农业大学，森林培育，2014，博士
【关键词】大果杏；AmEBP1；基因；基因转化；抗寒性；

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