1、人源P-糖蛋白高表达MDR1-MDCKII细胞模型的建立及应用 2、新型调血脂化合物IMM-H007的临床前药代动力学研究

【摘要】中草药作为一种传统的疾病治疗手段已有数千年的历史,近年来由于现代医学的发展,主要作为补充和替代医疗手段在世界范围内广泛应用。研究表明,中草药对于慢性或全身严重性疾病如癌症和艾滋病的治疗有着独特的优势,所以在临床治疗中中草药通常和其他处方药物联合应用以增加疗效,但同时也忽略了药物-药物相互作用(DDI)发生的可能性。在DDI的发生机制中,代谢性DDI尤其是药物代谢酶和药物转运体介导的DDI是最重要的两个机制。在过去的几十年里,药物代谢酶介导的DDI是主要的研究重点,而药物转运体介导DDI的研究报道相对较少。近年来由于药物转运体介导DDI的临床报道日益增多,药物与转运体之间的相互作用成为现代医学研究的重点之一。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)分子量约170kD,属于ABC转运蛋白超家族,由位于7q21的基因MDR1编码。P-gp除了在肿瘤细胞高表达介导多药耐药外,也存在于正常组织如小肠、肝脏、肾脏及某些特殊生理屏障如血脑屏障的毛细血管内皮细胞上。P-gp主要功能是利用ATP水解提供的能量,将细胞内的有毒物质或者药物通过胃肠道、胆汁和尿液排出体外,发挥其抵抗外来毒性物质侵袭的作用。由于P-gp的外排作用能够影响药物的生物利用度、肝肾排泄率和组织分布,因此P-gp的诱导或抑制可能引起体内药物间相互作用,增加DDI发生的可能性。这对于一些治疗指数小的药物如华法林、地高辛等尤其重要。对于治疗窗狭窄的药物而言,体内药物暴露量的微小波动可能导致临床疗效和毒性作用的显著变化,从而导致不良反应的发生。前期报道表明,多种传统中药材或中药材主要组分可影响P-gp的表达和活性。但由于人体口服中药后,真正进入体循环的中药有效成分常与中药原有成分不同,而这些中药有效成分和P-gp相互作用的文献资料相对较少。此外,不同实验室由于实验条件(环境、细胞类型和状态及给药剂量和给药时间)不同,同类研究可得出不同甚至是相反的实验结果。人源P-gp高表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型由于培养周期短,代与代之间均一性良好,常作为体外筛选P-gp底物和抑制剂的细胞模型,并可用于研究P-gp介导DDI发生的可能性。本研究应用逆转录病毒感染MDCKⅡ细胞的方法建立人源P-gp高表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型。应用此细胞模型研究了来源于25种临床常用中药的50种活性成分对P-gp活性的影响。此外,通过ATP酶活性测定初步探讨中药活性成分抑制P-gp的可能机制。应用分子对接技术分析中药活性成分和P-gp之间的构效关系。由于CYP3A4/5与P-gp有明显的底物和组织分布交叉性,因此进一步探讨具有P-gp抑制作用的中药活性成分对CYP3A4/5活性的影响。同时,应用大鼠体内模型评价活性成分与地高辛合用对药代动力学的影响,为临床DDI的发生提供有参考价值的实验依据。研究结果表明：1.人源P-糖蛋白高表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型的建立1.1酶切实验和DNA测序结果表明,携带目的基因MDR1的P-gp表达质粒pHaMDRwt可以在大肠杆菌中正确扩增和富集。1.2脂质体转染法介导pHaMDRwt质粒进入病毒包装细胞PA317,经秋水仙碱筛选后,可得到含有目的基因MDR1的高滴度逆转录病毒。病毒滴度经测定可达到8.8×10-5pfu/ml。1.3逆转录病毒感染MDCKⅡ细胞,经秋水仙碱筛选后,可得到人源P-gp高表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型。RT-PCR和westernblot结果表明,MDR1-MDCKⅡ细胞株可稳定高表达外源基因MDR1。Rho123外排实验和地高辛双向转运实验测定结果表明转染细胞中外源基因MDR1功能表达良好,可作为体外筛选P-gp底物和抑制剂的细胞模型。2.50种中药活性成分对P-糖蛋白和CYP3A4/5活性的影响及药物相互作用研究2.1MDR1-MDCKⅡ和Caco-2田胞双向转运实验结果表明,大黄素、18β-甘草次酸、脱水穿心莲内酯和20(S)-人参皂苷F1(≤100μM)对P-gp有显著的抑制作用(>50%),而上述化合物的同分异构体／结构类似物大黄酚、18a-甘草次酸、穿心莲内酯和人参皂苷Rh1对P-gp的活性影响相对较弱。2.2在MDR1-MDCKⅡ细胞中,对P-gp抑制活性最强的是大黄素(IC50=9.42μM)其次是18β-甘草次酸(IC50=21.78μM)、20(S)-人参皂苷F1(IC50=76.08μM)和脱水穿心莲内酯(IC50=77.80μM)。2.3大黄素和脱水穿心莲内酯剂量依赖性激活P-gpATPase舌性,Km和Vmax分别是48.61、29.09μM和71.29、38.45nmol/min/mgprotein。高浓度(100μM)18p-甘草次酸和20(S)-人参皂苷F1对空白和维拉帕米激活的P-gpATPase活性均有抑制作用。2.418β-甘草次酸、脱水穿心莲内酯、20(S)-人参皂苷F1和人参皂苷Rh1显著抑制CYP3A的代谢活性,抑制率分别是44、41、23和15%。大黄素可以显著激活CYP3A的代谢活性,与空白对照组相比,CYP3A舌性增加了35%。2.5分子对接研究初步阐明了中药活性成分和P-gp及CYP3A4之间的构效关系。结果表明,18-氢原子的差向异构(18β-甘草次酸)、氢键(大黄素)、双键(脱水穿心莲内酯)和糖基的取代位置(20(S)-人参皂苷F1)可能是化合物体现不同P-gp抑制活性的重要化学因素。与大黄酚、18a-甘草次酸、穿心莲内酯和人参皂苷Rhl相比,大黄素、18p-甘草次酸、脱水穿心莲内酯和20(S)-人参皂苷F1可以和P-gp形成更多的氢键作用,这可能是后者发挥更强活性的原因之一。此外,18p-甘草次酸和20(S)-人参皂苷F1均可和Arg212(CYP3A4与底物相互作用的重要氨基酸残基)形成一个较强的氢键,因此可能通过和咪达唑仑竞争性结合Arg212发挥CYP3A4抑制活性。而大黄素虽然和Arg212形成一个Pi键,但和CYP3A4之间的主要作用力是和Thr310形成一个较强的氢键,因此可能减少和咪达唑仑的竞争力而变构激活CYP3A4的活性。2.6SD大鼠提前口服大黄素或18p-甘草次酸后,地高辛的AUC0-t和Cmax与空白对照组相比,分别升高了51%和58%。综上所述,本研究应用逆转录病毒感染MDCKⅡ细胞的方法构建了人源P-gp高表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型,此模型稳定高表达外源基因MDR1,可作为体外筛选P-gp底物和抑制剂及研究化合物和P-gp相互作用的细胞模型。在选择研究的50种中药活性成分中,4种中药成分对P-gp有显著的抑制作用,分别为大黄素、18p-甘草次酸、脱水穿心莲内酯和20(S)-人参皂苷Fl。此外,具有P-gp抑制作用的中药活性成分可能同时抑制或激活CYP3A4/5的活性,因此临床联合用药时需注意DDI发生的可能性。上述研究为预测临床上由中药和其他处方药物合用引起相互作用的可能性提供科学、简便可靠的评价体系,并为指导临床合理用药提供有参考价值的实验依据。IMM-H007是一种新型调血脂化合物,化学结构为腺苷类似物。药理学研究表明,IMM-H007(10μM)可抑制十八烯酸诱导的脂肪性变HepG2细胞内脂质的堆积。体内药效学研究发现,IMM-H007(2mg/kg)可降低高脂血症金黄地鼠升高的血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和肝脏甘油三酯、总胆固醇水平。机制研究提示,IMM-H007可以上调十八烯酸诱导的脂肪病变HepG2细胞内或高脂血症金黄地鼠肝细胞内AMPK的磷酸化水平,是一种新型AMP-激活蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)激活剂。由此可见,IMM-H007作为一种与他汀类药物化学结构、作用靶点和代谢途径不同的新型调血脂化合物,有望成为临床预防和治疗心血管疾病的新药。前期药代研究表明,IMM-H007通过酯酶而非CYP450代谢。IMM-H007在体内首先发生水解反应,终末水解产物M1可进入细胞,经磷酸化反应生成MP(M1的5’-磷酸化产物),或发生脱氧、脱核糖环反应或Ⅱ相加合反应。MP的结构与5’-磷酸腺苷(AMP)极其相似,而AMP是AMPK的有效激活剂,因此推测MP可能为IMM-H007激活靶酶AMPK的活性代谢物。前期实验结果表明IMM-H007及代谢产物M1和MP在大鼠血浆和全血中的药代动力学特征明显不同,如MP在大鼠血浆内含量极低,主要存在于全血中。本论文初步探讨大鼠口服和静脉注射IMM-H007后,原型药及代谢产物M1和MP在大鼠全血内的药代动力学特点,并研究IMM-H007及M1在体外缓冲液和不同种属动物生物基质(血浆、全血、肝微粒体、肠道菌群)内的代谢稳定性,推测IMM-H007可能的代谢转化途径,为后期药代动力学研究提供有参考价值的依据。研究结果表明：1.生物样品中IMM-H007及代谢产物M1和MP的HPLC-MS/MS分析方法的建立根据临床前药代动力学指导原则,建立了生物样品中IMM-H007及代谢产物M1和MP的HPLC-MS/MS分析方法。结果表明,各检测物质在大鼠全血中均未见明显基质和杂质干扰,IMM-H007、M1和MP分别在1～500、2～1000和10～5000ng/ml浓度范围内线性关系良好,最低定量限分别为1、2和10ng/ml。各待测物质日内和日间精密度相对标准差均小于15%,准确度为±5.7%。IMM-H007、M1和MP的低、中、高3个QC浓度的全血样品回收率分别为80～91.2%、107.4～108.7%和76.4～80.3%。该方法简便、可靠、灵敏度高、特异性强,可满足IMM-H007的临床前药代动力学研究。2.大鼠口服和静脉注射IMM-H007的体内药代动力学研究2.1雄雌大鼠单次口服IMM-H007后吸收较快,各剂量组给药后5min血中即可检测到原型药和代谢产物,给药后12～36h血药浓度接近检测限。各时间点原型药浓度均较低(多个时间点浓度接近检测限),达峰浓度与剂量不成比例,药时曲线呈现多峰现象。2.2雄性大鼠口服不同剂量IMM-H007(50、50、450和900mg/kg)后,代谢产物M1的Cmax分别为37.52、61.13、82.69、141.18ng/ml,AUC0-t分别为160.47.328.71、799.57、1779.31h*μg/L,MRT0-t分别为3.18、3.93、7.5、11.3h；代谢产物MP的Cmax分别为88.2、153.46、204.95、309.42ng/ml,AUC0-t分别为362.71、676.26、2230.14、4536.37h*μg/L,MRT0-t分别为2.87、3.65、8.15、12.07h。代谢产物M1和MP的Cmax与AUC0-t均随给药剂量增加而递增,并与给药剂量呈正比,但两者的MRT0-t均随剂量增加而延长,提示代谢产物M1和MP在大鼠体内可能存在消除饱和现象。2.3雌性大鼠口服不同剂量IMM-H007(50、150、450和900mg/kg)后,代谢产物M1的Cmax分别为37.78、210.72、256.89、325.77ng/ml,AUC0-t分别为151.87、854.34、1561.42、3334.16h*μg/L、MRT0-t分别为3.85、4.25、7.62、10.51h；代谢产物MP的Cmax分别为132.55.920.83、1214.01、1122.64ng/ml,AUC0-t分别为698.63、4000.82、8376.97、13900.82h*μg/L,MRT0-t分别为4.08、4.86、8.45、10.3h。代谢产物M1和MP的AUC0-t均随剂量增加而递增,呈现一定比例关系,但中、高剂量组M1和MP的Cmax与给药剂量不成比例,且两者的MRTo_t均随剂量增加而延长。上述结果提示代谢产物M1和MP在雌性大鼠体内可能存在吸收和消除饱和现象。2.4雌性大鼠中、高剂量组代谢产物M1和MP的Cmax和AUCo-t均高于雄性大鼠,提示代谢产物M1和MP在大鼠体内的药代动力学存在一定的性别差异。2.5IMM-H007的生物利用度以M1计算,雄鼠为3.04%,雌鼠为2.12%；以MP计算,雄鼠为5.61%,雌鼠为6.55%,无明显性别差异。3.IMM-H007的体外代谢稳定性研究3.1IMM-H007和代谢产物M1在人工胃液、人工肠液和Tris-HCl缓冲液中稳定性良好,4h后剩余量均高于85%。3.2IMM-H007在不同种属动物(SD大鼠、C57小鼠、金黄地鼠、比格犬、食蟹猴、人)血浆中(温孵时间为2h)均不稳定,且呈现种属差异性,代谢稳定性结果为比格犬>人>食蟹猴>SD大鼠、C57小鼠、金黄地鼠。M1在体外不同种属动物血浆中均较稳定。体外温孵体系中无MP的生成。3.3IMM-H007在不同种属动物(SD大鼠、C57小鼠、金黄地鼠、比格犬、食蟹猴、人)肝微粒中(温孵时间为2h)均不稳定,5min即减少90%以上,且IMM-H007减少程度不依赖NADPH。M1在体外不同种属动物肝微粒中均较稳定。体外温孵体系中无MP的生成。3.4IMM-H007和M1在不同种属动物(SD大鼠、C57小鼠、金黄地鼠、比格犬、食蟹猴、人)全血中(温孵时间为2h)均不稳定,温孵体系中可检测到MP的生成。除比格犬外,其他动物全血中水解产物M1的生成随着原型药的减少均呈现先上升后下降趋势,而MP则一直呈现递增趋势。3.5IMM-H007在体外大鼠肠道菌群中(温孵时间为8h)不稳定,可生成代谢产物M444、M402、M1、M344和M228。其中M444、M402和M1在体系中含量呈先上升后下降趋势；代谢产物M344和M228呈递增趋势。M1在体外大鼠肠道菌群中不稳定,可生成代谢产物M344和M228,其中M344含量呈先上升后下降趋势；M228呈递增趋势。综上所述,本研究建立了生物样品中IMM-H007及代谢产物M1和MP的HPLC-MS/MS分析方法,该方法简便、可靠、灵敏度高、特异性强,可满足IMM-H007的临床前药代动力学研究。应用此分析方法初步探讨了大鼠口服和静脉注射IMM-H007后,原型药及代谢产物M1和MP在雌雄大鼠全血内的药代动力学特点。体外代谢稳定性结果表明IMM-H007和M1在体外不同种属动物全血和大鼠肠道菌群中均不稳定,可生成水解、脱氧、脱核糖环或磷酸加合产物。此研究为了解IMM-H007可能的代谢转化途径及后期药代动力学研究提供有参考价值的实验数据。
【作者】李雪；
【导师】李燕；
【作者基本信息】北京协和医学院，药理学，2014，博士
【关键词】MDR1-MDCKII细胞；中药活性成分；P-糖蛋白；CYP3A4；药物-药物相互作用；IMM-H007；M1；MP；药代动力学；代谢稳定性；

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