1、RPS27a对慢性粒细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响 2、IDH1~(R132H)突变蛋白和AML1-ETO融合蛋白协同作用的研究

【摘要】目的：探讨RPS27a在白血病中的作用,为白血病的靶向治疗寻求新的治疗靶点。方法：(1)应用实时定量PCR(Real-timequantitativePCR,qRT-PCR)技术检测RPS27a和Uba52在26例慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)患者(包括16例慢性期CML和10例加速期或急变期CML)和15例健康供者骨髓单个核细胞中的mRNA水平,同时检测RPS27a在12例经治疗达完全细胞遗传学缓解(completecytogeneticresponse,CCyR)的CML患者和20例初诊急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA水平。应用qRT-PCR和Westernblot检测常见白血病细胞系Nalm6、NB4,HL60、K562、U937、Kasumi-1、SKNO-1和K562/G01中RPS27a的mRNA和蛋白水平。(2)应用短发夹RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)干扰技术将K562细胞和对伊马替尼耐药细胞系K562/G01细胞中的RPS27a沉默,建立稳定干扰细胞克隆,qRT-PCR和Westernblot验证shRNA干扰效果。MTT法检测K562干扰细胞(K562-sh1,K562-sh2和K562-scr)及K562/G01干扰细胞(K562/G01-sh1,K562/G01-sh2和K562/G01-scr)的增殖能力；应用流式细胞术检测K562-sh1,K562-sh2和K562-scr及K562/G01-sh1,K562/G01-sh2和K562/G01-scr的细胞周期变化。不同浓度(0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM和8μM)伊马替尼处理K562-sh1,K562-sh2和K562-scr及K562/G01-sh1,K562/G01-sh2和K562/G01-scr两组细胞,MTT检测细胞增殖抑制情况,据其计算两组细胞对伊马替尼48h和72h的IC50。应用0.5μM和1μM伊马替尼处理K562-sh1,K562-sh2和K562-scr细胞；2μM和4μM伊马替尼处理K562/G01-sh1,K562/G01-sh2和K562/G01-scr细胞,分别处理24h和48h,AnnexinV/PI双标法在流式细胞仪上检测细胞的凋亡比例,同时收集伊马替尼处理48h的细胞,Westernblot检测细胞中cleaved-PARP、PARP、cleaved-caspase3和caspase3蛋白水平的变化。(3)Westernblot法检测K562-sh1,K562-sh2和K562-scr及K562/G01-sh1,K562/G01-sh2和K562/G01-scr细胞中细胞增殖相关信号通路关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT等；细胞周期调控关键分子P21；细胞凋亡相关分子BCL-2、BCL-XL和Bax的变化。(4)应用不同浓度(0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM和8μM)组蛋白去乙酰化酶抑制剂suberoylanilidehydroxamicacid(SAHA)和不同浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM)细胞周期依赖性抗肿瘤药物依托泊苷(VP16)处理K562-sh1,K562-sh2和K562-scr细胞。MTT法检测K562-shl,K562-sh2和K562-scr对SAHA和VP16的IC50,AnnexinV/PI双标法在流式细胞仪上检测不同浓度SAHA(0μM、1μM、2μM和5μM)和VP16(0μM、2μM和5μM)处理的K562-sh1,K562-sh2和K562-scr细胞的凋亡比例。结果：(1)与健康对照组相比,慢性期CML患者RPS27a基因mRNA水平明显低表达(P<0.01)；而加速期或急变期CML和AL患者RPS27a基因mRNA水平显著升高(P<0.01)；经治疗达CCyR的CML患者RPS27a基因mRNA水平下降至正常水平(P>0.05)。另外,加速期或急变期CML和AL患者RPS27a基因mRNA水平之间无显著性差异(P>0.05)。与健康对照组相比,慢性期CML、加速急变期CML患者Uba52mRNA水平均无统计学差异(P>0.05)。常见白血病细胞系Nalm6、NB4、HL60、K562、U937、Kasumi-1和SKNO-1等细胞表达相似的RPS27a水平；而对伊马替尼耐药的K562/G01细胞的RPS27a水平较K562细胞显著升高。而Uba52的mRNA水平在慢粒慢性期、加速期或急变期和健康供者组之间无显著差异(P>0.05)。(2)特异性干扰RPS27a的K562细胞和K562/G01细胞较对照组细胞增殖减慢(P<0.01)、更多细胞停滞于S期和G2/M期(P<0.01)、对伊马替尼的敏感性增加、更容易发生由伊马替尼诱导的细胞调亡(P<0.01)。经伊马替尼处理48h后的K562细胞和K562/G01细胞表达更多的cleaved-PARP和cleaved-caspase3,而相应的]PARP、caspase3水平下降。(3)在K562和K562/G01细胞中,干扰RPS27a后,p-ERK水平下调、P21水平上调、BCL-2水平下调。(4)干扰RPS27a的K562细胞对SAHA和VP16的IC50下降,更容易发生由SAHA和VP16诱导的细胞凋亡。结论：RPS27a在白血病细胞中起促进细胞增殖、调控细胞周期进程和抑制细胞凋亡的作用,可能参与了CML细胞的疾病转化和对酪氨酸激酶抑制剂耐药的发生。特异性抑制RPS27a蛋白并联合化疗药物的方案可能有助于白血病的治疗。细胞的增殖和分化受到内在和外在信号严格调控。异常的增殖和分化可能导致造血细胞的恶性转化和白血病的发生。根据“二次打击”学说,白血病的发生一般是多个基因改变的综合结果。AML1-ETO是急性髓系白血病(acutemyeloid1eukemia,AML)M2b的重要标志,是t(8;21)(q22；q22)易位的融合基因产物。IDH1突变首先先从神经胶质瘤中发现,后来又在AML及其他一些肿瘤中发现。在AML1-ETO阳性急性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)患者中存在12%IDH1突变,同时携带AML1-ETO融合蛋白和IDH1突变的患者预后较差。我们推测,AML1-ETO和IDH1突变蛋白双重打击可能有助于白血病的发生,两者之间可能存在某种协同关系。目的：探索AML1-ETO融合蛋白与IDHl蛋白较常见突变IDH1R132H蛋白之间有无协同作用。方法：构建pMSCV-IDH1R132H-cFlag-IRES-GFP(MH)、pMSCV-AML1/ETO-IRES-GFP(MA)、pMSCV-IDH1R132H-2A-AML1/ETO-IRES-GFP(M2A).pMSCV-IDH1R132H-IRES-AML1/ETO-IRES-GFP(MIA)等重组质粒。通过逆转录病毒载体将pMSCV-IRES-GFP(MV)、MA、MH、MIA和M2A质粒转导至小鼠骨髓细胞系32D细胞中,实时定量PCR(Real-timequantitativePCR,qRE-PCR)和Westernblot验证AML1-ETO和IDH1R132H基因mRNA和蛋白水平的表达。不同IL-3浓度条件下培养各组32D细胞,采用MTT实验检测其增殖能力、集落形成实验检测其集落形成能力、流式细胞术检测撤退IL-3后细胞凋亡情况。结果：在不同IL-3浓度(0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml和10ng/m1)条件下,较对照组相比,同时表达IDH1R132H和AML1-ETO蛋白的32D细胞细胞增殖、集落形成能力及撤退IL-3诱发的细胞凋亡率之间差别均无统计学意义。结论：IDH1R132H和AML1-ETO蛋白两者同时表达不能促进细胞增殖、抵抗细胞凋亡。IDH1R132H和AML1-ETO蛋白无明显协同作用。
【作者】王厚才；
【导师】王建祥；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2014，博士
【关键词】RPS27a；伊马替尼；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡；IDH1R132H突变；AML1-ETO；32D细胞；协同作用；

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