人脂肪来源间充质干细胞（hAD-MSC）联合重复经颅磁刺激（rTMS）治疗大鼠外伤性脑损伤（TBI）

【摘要】研究背景和目的外伤性脑损伤(TraumaticBrainInjury,TBI)是指因外部原因引起的脑功能或脑病理学的改变,是世界性的公共卫生问题。现有的针对TBI的治疗尚不能彻底恢复受损的神经功能。研究证实,成体脑内尚存在具有产生新生神经元功能的细胞。但是,从患者恢复的结果来看,这种内源性神经修复功能的效果是不足的。在过去的几十年里,干细胞替代治疗逐渐成为治疗神经系统损伤的热点,并且在世界范围内进行了广泛的研究。间充质干细胞(MesenchymalStromalCell,MSC)由于其具有获取容易,且几乎存在于所有组织中,例如骨髓、脂肪组织、脐带、新生儿肝脏、肌肉及肺部等,并且容易体外扩增等特点,从而成为干细胞治疗的主力军[3-5]。目前已经有诸多动物实验证实MSC,对TBI、脑中风、神经退行性疾病等具有治疗作用[6-10]。目前认为MSC通过分泌一系列因子,达到促进神经发生(Neurogenesis)、血管发生(Angiogenesis),减轻细胞凋亡,控制炎症的目的。重复经颅磁刺激Repetitivetranscranialmagneticstimulation(rTMS),作为神经系统疾病的新的研究工具,近二十年慢慢用于临床。因其无创、简单易行、较好的定位性,无需进行大量临床前研究即可用于临床,因此广泛应用于临床多种神经系统疾病的诊断、治疗以及研究。大量临床研究证实TMS能够改善脑外伤患者的康复。TMS治疗脑外伤的机制虽然尚不完全清楚,但目前的观点认为主要通过对神经兴奋性的调控,表现为长时程增强(Long-termPotentiation,LTP)/长时程抑制(Long-termDepression,LTD)来发挥其治疗作用。一般认为高频rTMS能够诱导LTP,从而改善TBI后神经功能的恢复。目前尚无TMS联合MSC治疗TBI的研究,本研究将首次探索MSC脑内移植,联合rTMS干预治疗对TBI后大鼠脑内神经发生、损伤灶周边凋亡机制进行探索。方法成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重210-249g,利用Feeney自由落体法制作大鼠TBI模型。用改良神经功能严重程度评分(mNSS)评价大鼠造模术后第1、7、14及28天的行为学表现。根据POI评分,将大鼠分层随机分为①单纯损伤组；②损伤+TMS组；③损伤+hAD-MSC组；④损伤+TMS+hAD-MSC组。于术后第2天开始TMS,具体参数如下：放电电压700V,频率5Hz,第②、③组每只大鼠每日接受900个脉冲刺激。于术后第2天行hAD-MSC脑内植入术,第③、④大鼠各植入hAD-MSC5*105。分别在术后第7、14及28天三个时间点将大鼠分批处死,予生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌流后取脑,石蜡包埋切片,行HE和免疫组化染色。免疫组化指标：细胞增殖标记物BrdU,神经干细胞及祖细胞标记物musashil,成熟神经元标记物NeuN,细胞凋亡标记物caspase-3,hAD-MSC标志物抗人核单克隆抗体。部分大鼠在P02、P05和P013行18F-FDGmicro-PET检查。结果1、P02开始,TMS干预组较无TMS干预组能够显著降低TBI后大鼠死亡率(two-wayANOVA,p=0.025);PO14起TMS有改善TBI后大鼠行为学评分的趋势(two-wayANOVA,p=0.104),表现为mNSS的降低。P028开始,TMS能够显著降低TBI后大鼠损伤侧脑实质的减少(two-wayANOVA,p=0.045)。PO13开始,TMS有提高TBI后大鼠损伤灶周边代谢的趋势(two-wayANOVA,p=0.075)。尚不能证明TMS具有促进TBI后大鼠内源性神经发生,以及抑制损伤灶周边细胞凋亡的作用。2、P02开始,MSC干预组较无MSC干预组能够降低TBI后大鼠死亡率,但无统计学差异(two-wayANOVA,p=0.800);PO14起MSC有改善TBI后大鼠行为学评分的趋势(two-wayANOVA,p=0.179),表现为mNSS的降低。P028开始,MSC有降低TBI后大鼠损伤侧脑实质的减少的趋势(two-wayANOVA,p=0.181)。PO13开始,MSC有提高TBI后大鼠损伤灶周边代谢的趋势(two-wayANOVA,p=0.136)。P028开始,MSC有显著促进TBI后大鼠SVZ区细胞增殖的作用,表现为BrdU+细胞计数较无MSC组的升高(two-wayANOVA,p=0.012),但Musashil染色并无显著差异。尚不能证明MSC具有促进TBI后大鼠内源性神经发生、以及抑制损伤灶周边细胞凋亡的作用。3、研究尚不能证明TMS与MSC之间在治疗TBI后大鼠上有相互协同或相互抑制的作用。4、抗人核单克隆抗体追踪植入TBI后大鼠脑内hAD-MSC结果显示,移植后28d仍有绝大多数大鼠可检测到存活hAD-MSC。存活的hAD-MSC几乎全部分布于梗死灶周边。结论1.脑内移植hAD-MSC具有显著提高SVZ区细胞增殖的作用,以及具有改善损伤灶周围脑代谢及减少TBI后脑实质的减少的趋势。尚不能证明hAD-MSC有降低损伤灶周边细胞凋亡的作用。2.TMS能够显著降低TBI大鼠的死亡率及TBI后脑实质的减少,并且有改善损伤灶周围脑代谢的趋势,这种作用可能与TMS改善损伤灶周围血供、降低炎症反应相关。该研究尚不能证明TMS有促进内源性神经发生、降低损伤灶周边细胞凋亡的作用。3.hAD-MSC*TMS二者之间没有显著的交互作用。4.hAD-MSC移植到脑内后几乎全部分布于损伤灶周边,至术后28天绝大多数大鼠仍可检测到hAD-MSC的存活。
【作者】李剑涛；
【导师】任祖渊；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】脂肪来源间充质干细胞；移植；经颅磁刺激；外伤性脑损伤；凋亡；内源性神经发生；

【参考文献】
[1]邢闯锋.冻融节理岩体损伤断裂特性及有限元分析研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[2]钱坤.环保部门设备管理系统的设计与实现[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[3]张纹.基于纳米材料构建的生物传感器应用于多组分小分子检测的研究[D].西南大学,2014.
[4]岳洋西.维特根斯坦语言游戏中语句匹配关系的语言哲学研究[D].西南大学,英语语言文学,2014,硕士.
[5]郭玉平,蒲剑.光网络设备如何适应分组业务的发展[J].世界电信.2005(09)
[6]刘枫艳.论《砖巷》的叙事空间建构[D].福建师范大学,比较文学与世界文学,2012,硕士.
[7]汪琴.中国优秀传统文化与高校思想政治教育[D].南昌大学,思想政治教育,2012,硕士.
[8]顾敏敏.主题推理加工中的个体差异及时间进程[D].河北师范大学,基础心理学,2004,硕士.
[9]白晨曦.发展中的城市伙伴制[J].国外城市规划.2004(04)
[10]刘爽英,贺利坚.企业数据仓库设计方法研究[J].华北工学院学报,2001,06:461-463.
[11]阮久勇.药物中间体（S）-3-苯甲酰巯基-2-甲基丙酸的合成研究[D].大连工业大学,材料学,2012,硕士.
[12]谯倩.激励对中国农村小学生成绩的影响[D].山东大学,金融学,2013,硕士.
[13]焦剑,崔永红,蔡宇.块状无裂纹介孔炭的合成和表征[J].炭素技术,2014,04:26.
[14]赵明章,范雪辉,刘春芳,于京波,史彩娟,何丽红,陈志刚,宋德才.利用构造导向滤波技术识别复杂断块圈闭[J].石油地球物理勘探,2011,S1:128-133+163+173.
[15]李振.基于城市污水再生的PVDF/PVP改进超滤膜膜清洗方式与调控试验研究[D].西安建筑科技大学,市政工程,2013,硕士.
[16]陆宇荣.浙江旅游人才培育战略研究[J].太原城市职业技术学院学报,2014,06:3-5.
[17]陈育英.血脂与急性脑血管病关系的研究[D].苏州大学,神经病学,2003,硕士.
[18]李冬青.关于模糊积分不等式理论及应用研究[D].中国矿业大学,计算数学,2014,硕士.
[19]范磊.转型变革情景下职业经理人胜任能力模型与开发策略研究[D].浙江大学,2014.
[20]张燕.30～36月龄儿童对他人视、听、触觉信息理解能力的实验研究[D].西北师范大学,学前教育学,2014,硕士.
[21]吴永兴.PASSIM-12K卷接机料斗烟丝辅助调整系统研制[D].重庆大学,机械工程,2003,硕士.
[22]程鑫.金属有机骨架材料ZIF-8（I_2）的湿敏性能研究[D].吉林大学,集成电路工程,2013,硕士.
[23]孙楼.植物甾醇在畜禽生产上的初步推广应用[D].南京农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[24]史小红.我国度假酒店发展策略分析[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[25]付诗云.城市街道步行空间的人性化设计研究[D].湖北工业大学,设计艺术学,2014,硕士.
[26]贾磊,裴仁清.关于关联规则算法中规则遗失问题的研究[J].计算机工程,2003,12:29-30+141.
[27]许多姿.新中式室内设计风格研究[D].中南林业科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[28]白媛媛.大学生感恩、负性生活事件与幸福感的关系研究[D].南京师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[29]唐昊霞.基于无线传感器网络Potts-Model的目标追踪算法研究[D].华中师范大学,计算机系统结构,2014,硕士.
[30]吕仲菲.介孔磺化密胺树脂的制备与催化性能研究[D].浙江大学,化学,2013,硕士.
[31]郑光明,孙星明.基于差错控制的关系数据库数字水印[J].计算机工程与应用,2005,18:166-168+203.
[32]邵吉光,冯国臣,付盛.极值与切线的运动学原理[J].高等数学研究,2014,03:4-7.
[33]曹桂彬.牛子宫内膜炎病的诊断及临床治疗研究[D].河南农业大学,兽医（专业学位）,2012,硕士.
[34]程颖.论档案文化生态系统及控制[D].湖北大学,档案学,2012,硕士.
[35]光奇.电子病历系统的设计与实现[D].兰州大学,计算机技术,2012,硕士.
[36]冉延平,余昭平,贾利新,康学福.基于混合模型的聚类算法研究[J].河南科学,2005,03:324-327.
[37]张洁.基于ACK流量异常的慢速拒绝服务攻击检测方法[D].华中科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[38]郭屹.当代大学生心理疏导问题研究[D].吉林大学,思想政治教育,2013,硕士.
[39]李峰.人民币有效汇率对我国进出口商品价格的影响研究[D].山西财经大学,数量经济学,2013,硕士.
[40]刘浏.基于均分优化UIO方法的DHCP协议一致性测试系统设计与实现[D].国防科学技术大学,软件工程,2012,硕士.
[41]闻小刚.阳离子分散松香胶的制备工艺及其改性研究[D].江西农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[42]张倩.“把N-V”及其他无补“把”字句研究[D].北京大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[43]雷震洲.美国流行什么服务?[J].中国电信业.2003(03)
[44]朱迟.黑龙江省农业科技成果转化问题研究[D].吉林大学,农业推广,2012,硕士.
[45]张玮.面向HEVC视频编码标准的视频质量评价分析与研究[D].上海交通大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[46]刘非.我国古代中央与地方关系的研究[D].中共北京市委党校,行政管理,2013,硕士.
[47]徐楠.基于Web of Things技术的智能家居终端应用的设计与实现[D].北京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[48]张立,孙儒泳,房继明.雄性布氏田鼠对不同熟悉程度和动情状态下雌鼠气味的辨别[J].动物学报,2002,01:27-34.
[49]卢勇.中新广州知识城管理体系研究[D].兰州大学,行政管理,2012,硕士.
[50]王金生,姚春燕,彭伟,金鑫,陈世杰.游离磨料多股线线锯切割实验研究[J].中国工程科学,2012,11:94-98.