Rheb基因对绒山羊骨骼肌卫星细胞的影响

【摘要】Rheb(RasHomologEnrichedInBrain)是高度保守的小G蛋白,属于RAS家族中的重要基因,它在动物个体的多种器官及组织中表达。Rheb具有多种功能,其中包括：促进脂肪的形成与储存,调控细胞周期,调控心肌细胞生长等作用。近年来研究发现,肌肉的生长发育与mTOR信号通路密切相关,而Rheb作为mTOR信号通路上游的调控基因,可以通过该信号通路来调控肌细胞的生理功能。本研究通过在体外培养的阿尔巴斯绒山羊骨骼肌卫星细胞中过表达或干涉Rheb基因,探讨Rheb基因对绒山羊肌卫星细胞的作用及影响。1.Rheb过表达载体及干扰载体的构建我们首先克隆了阿尔巴斯绒山羊的Rheb基因cDNA序列,然后分别构建了Rheb基因过表达载体及干扰载体。Rheb过表达载体由CAG启动子、Rheb、IRES、AcGFP组成：CAG可以高效启动目的基因表达,下游紧接IRES-AcGFP元件,方便我们从细胞发出的绿荧光来判断Rheb的表达情况。针对Rheb基因cDNA序列信息,我们同时设计构建了四种Rheb干扰载体和一种对照载体。我们将四种干扰载体分别转染绒山羊骨骼肌卫星细胞,提取细胞总RNA,通过RT-PCR反应筛选抑制效率最高载体,发现miRNA-4抑制效率最高,可以用于Rheb基因干涉。2.Rheb过表达对骨骼肌卫星细胞发育及相关基因表达的影响利用脂质体介导的方法将Rheb过表达载体转染体外培养的绒山羊骨骼肌卫星细胞,使用流式细胞仪检测细胞的转染效率、电子体积及细胞周期,结果显示肌肉卫星细胞的转染效率低于胎儿成纤维细胞。Rheb基因过表达后对肌肉卫星细胞的大小及细胞周期的影响不明显。接下来我们检测了Rheb基因过表达后肌肉发育相关基因的表达变化,结果发现,肌细胞中Rheb的上调可以引起MSTN表达量上升；S6K表达量无明显变化；MyHC、DES、MyoD、Myf5、MyoG、Myf6、MCK等基因都有不同程度的下降。3.Rheb干扰对骨骼肌细胞及其发育相关基因表达的影响利用脂质体介导的方法将Rheb干扰载体转染到绒山羊骨骼肌卫星细胞中,使用流式细胞仪检测细胞的转染效率、电子体积及细胞周期,结果显示Rheb基因消减后,骨骼肌卫星细胞的大小和细胞周期没有明显变化。Rheb基因消减后,我们对肌肉发育相关基因的表达也进行了检测,结果发现肌卫星细胞中Rheb的下调可以引起MSTN表达量下降,而S6K表达量无明显变化,MyHC、MyoD、DES、Myf5、MyoG、Myf6、MCK等基因的表达均有不同程度的上升。
【作者】王景圆；
【导师】仓明；
【作者基本信息】内蒙古大学，动物学，2014，硕士
【关键词】Rheb；骨骼肌卫星细胞；MSTN；MyoG；脂质体转染；miRNA；

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