HDAC6在APPswe/PS1ΔE9阿尔茨海默病转基因模型小鼠发病机制中的作用

【摘要】背景阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种以认知功能进行性减退为主要临床表现的神经退行性病变。其确切的病因尚不清楚,近年来有研究显示组蛋白去乙酰化酶6(histonedeacetylase6,HDAC6)在AD病人的海马和皮层中表达增加,但其过表达的作用尚存在争议。方法应用免疫组化的方法检测HDAC6在成年C57BL/6J野生小鼠全脑组织内的表达分布情况；应用免疫荧光双标技术检测HDAC6在各类脑细胞中的表达；应用免疫组织化学和免疫印迹检测HDAC6和其底物乙酰化α-微管蛋白(ace-α-tubulin,K40)在1、3、6、9月龄野生型C57BL/6J小鼠和APPswe/PS1ΔE9(PAP)阿尔茨海默症模型小鼠脑组织中表达的变化。将PAP模型小鼠的Hdac6敲除后获得PAP×Hdac6KO小鼠。PCR鉴定其基因型,免疫印迹和组织化学方法检测HDAC6和ace-α-tubulin在6月龄WT、PAP、Hdac6KO和PAP×Hdac6KO小鼠脑组织的表达情况；应用开放旷场实验检测小鼠的自主活动和焦虑情绪,新物体识别实验和Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力的改变；硫磺素-S荧光染色观察老年斑的改变；ELISA检测小鼠脑内可溶性和不可溶性Aβ40/42的含量；免疫印迹检测小鼠脑内过度磷酸化tau蛋白(P-tau)和GSK3β磷酸化的水平；透射电镜分析微管超微结构的改变。另外,本实验选取了两种具有临床应用前景的HDAC6特异性抑制剂tubastatinA和ACY-1215,观察它们对6月龄PAP小鼠认知功能的影响并进行初步的机制研究。将6月龄PAP小鼠随机分为模型组、溶剂对照组(vehicle,DMSO/生理盐水=1：10)、阳性对照组(SAHA,50mg/kg)、tubastatinA组(25mg/kg)和ACY-1215组(25mg/kg)。并以同窝阴性的C57BL/6J小鼠作为正常对照组(WT),每组16只,雌雄各半,腹腔注射连续给药20天。每4天称一次小鼠体重。注射结束后进行旷场实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验来观察tubastatinA和ACY-1215对AD模型小鼠自主活动和认知功能的影响；检测脑重和肝肾功能各项指标；应用开放旷场实验检测小鼠的自主活动和焦虑情绪,新物体识别实验和Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力的改变；检测脑重和肝肾功能各项指标；免疫印迹和免疫组织化学检测小鼠皮层和海马内HDAC6;和α-tubulin的乙酰化水平；6E10免疫染色和硫磺素-S染色检测脑内老年斑沉积；ELISA检测小鼠脑内可溶性和非可溶性Aβ40和Aβ42含量；免疫印迹检测脑内APP降解相关酶和产物,自噬相关蛋白的表达,P-tau的水平,脑信号转导通路分子P-GSK3β、P-Akt及P-mTOR的变化；透射电镜检测脑组织超微结构的变化。结果HDAC6在成年C57BL/6J小鼠脑组织内分布较为广泛,但具有相对区域特异性：在海马、皮层和杏仁核等与认知相关脑区的表达最为丰富；有细胞特异性：主要分布在各类神经元的细胞浆中,而在胶质细胞中无表达。HDAC6在WT和PAP小鼠海马和皮层的表达随年龄增加而明显增多。与同龄WT小鼠相比,AD小鼠脑中HDAC6的表达从3月龄开始明显增多,且随年龄增加HDAC6过表达的趋势更明显,ace-a-tubulin相应减少。与PAP小鼠相比,Hdac6敲除后并不影响小鼠的自主活动和焦虑情绪,但能明显改善其认知功能,PAP×Hdac6KO小鼠脑内老年斑沉积未有明显变化,但ELISA检测结果显示其脑内可溶性Aβ42的含量明显减少,tau蛋白的磷酸化水平显著降低,P-GSK3p的表达明显上调,Hdac6敲除可明显改善PAP小鼠脑中微管的超微结构。TubastatinA和ACY-1215能明显抑制HDAC6勺活性,改善PAP小鼠的认知功能,减少老年斑的沉积和可溶性Aβ40/42的含量,抑制APP的β/γ-切割和GSK3(3的活性,降低tau蛋白的磷酸化水平,促进自噬清除过程,并改善微管的超微结构,而对小鼠的自主活动和焦虑水平及体重、脑重和肝肾功能无明显影响。结论HDAC6的正常表达可能对维持认知相关脑区神经元的正常功能具有重要作用。HDAC6过表达在AD中很可能通过影响Ap/P-tau的生成和自噬清除发挥了神经损伤作用。HDAC6是很可能是AD的治疗靶点,HDAC6特异性抑制剂tubastatinA和ACY-1215或许是治疗AD的潜在药物。
【作者】张玲；
【导师】秦川；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】阿尔茨海默病；HDAC6；tau；Aβ；自噬；

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