胃泌素通过诱导肾脏摄取L-DOPA增加多巴胺合成参与血压调节

【摘要】第一部分：胃泌素通过诱导肾脏摄取L-DOPA增加多巴胺合成参与血压调节背景及目的原发性高血压(EssentialHypertension,EH)是一种严重危害人类健康的多因素疾病,其发病趋势逐年上升。动脉血压不仅决定于血管阻力,也决定于心输出量。心输出量受到细胞外液钠容量,肾功能等因素的影响,总外周阻力则受交感神经系统、儿茶酚胺等激素的影响。新近研究发现,胄泌素(多肽类激素)不仅能够调节胃酸分泌,而且,对体内钠离子平衡有重要的调节作用。而多巴胺在钠水代谢及血压调节方面的重要作用已被业界公认。所有多巴胺受体亚型均直接或间接地通过与其他血压调节系统交互作用,参与肾脏钠排泄和血压的调节。本文就胃泌素与多巴胺相互作用的可能机制进行探索研究,从全新的视角阐述其在血压调控中的作用,为原发性高血压的防治提供新靶点。方法于安徽省阜阳市人民医院对高血压人群(HT,n=95)和正常人群(NT,n=82)进行研究。分光法检测空腹状态下血生化指标。放射免疫法检测空腹和餐后30,60,120分钟血清胃泌素以及空腹肾素,血管紧张素和醛固酮激素含量变化情况并监测各个时间点的血压变化。通过相关性分析基础状态下胃泌素与肾素,血管紧张素和醛固酮激素的相关性。于培养有小鼠和人肾脏近曲小管细胞(Mouseproximaltubularcells,MPTCsandHumanproximaltubularcells,HPTCs)的培养基中加入100uM的L-DOPA,同时加入胃泌素,并且设定两个浓度50ng/ml和100ng/ml,ELISA法检测生成多巴胺的量,判断胃泌素的最佳用药浓度。在细胞培养基中加入L365,260(CCKB拮抗剂)或BCH(L-氨基酸转运体抑制剂)预处理6分钟,而后加入100uM的L-DOPA和100ng/ml胃泌素,检测生成多巴胺的量。BCA法检测细胞蛋白浓度。Westernblotting方法检测药物处理细胞LAT1总蛋白和膜蛋白的表达情况。将新鲜小鼠肾脏切碎加入细胞培养基中培养采用同浓度的L-DOPA(?)胃泌素处理,检测组织生成的多巴胺的量。Westernblotting方法检测药物处理小鼠肾脏组织LAT1总蛋白和膜蛋白的表达情况。无菌制备胃泌素siRNA,为单侧肾脏切除的Balb-C小鼠植入迷你泵,连续释放胃泌素siRNA,沉默胃泌素基因。股动脉插管测定胃泌素siRNA和mocksiRNA注射前后的动脉血压。Westernblotting方法检测肾脏组织胃泌素蛋白表达,PCR方法检测胃泌素mRNA的表达情况。Westernblotting方法检测胃泌素siRNA和mocksiRNA处理小鼠肾脏组织LAT1总蛋白和膜蛋白的表达情况。结果人群实验显示胃泌素与高血压密切相关。HT组和NT组空腹胃泌素水平无明显差异,但HT组餐前血压显著高于正常组(P<0.05)。餐后HT组血压显著降低但120分钟后并未恢复且持续降低差异显著(P<0.05),而正常组餐后血压较餐前并无显著性降。血清胃泌素监测显示HT组餐后血清胃泌素变化趋势与对照组相似,即30分钟时胃泌素水平达到峰值随后逐渐降低。但HT组血清胃泌素水平在餐后30,60,和120分钟显著高于正常组(P<0.05)空腹状态下HT组胃泌素水平与醛固酮和血管紧张素Ⅱ有显著相关性(P<0.05)。基础研究说明胃泌素能够使小鼠和人源肾脏近曲小管细胞摄取更多的L-DOPA,生成多巴胺增多。L365,260预处理细胞结果证实了胃泌素刺激多巴胺的生成是通过作用于CCKBR而发牛。L-氨基酸转运体抑制剂BCH能够使L-DOPA摄取显著降低(P<0.01),证实了钠离子依赖型L-氨基酸转运体在胃泌素诱导的L-DOPA摄取中起主导作用。Westernblotting检测结果显示胄泌素诱导机制为,够刺激细胞膜LAT1数量增多,而非总LAT1表达增加。MPTCs摄取L-DOPA的量显著低于HPTCs(12±1.5vs28±1.9P<0.05)。造成这一结果的原因可能是小鼠细胞来源于C57BL/6J,该小鼠可能存在L-DOPA摄取障碍。离体实验同样证实了胃泌素对于体内多巴胺的正常合成和血压起到非常重要的作用。结论我们首次通过流行病调查的方法显示了高血压人群餐后胃泌素显著升高,并且证实空腹状态下胃泌素与血管紧张素Ⅱ和醛固酮有显著相关性,证实了胃泌素与血压调节密切相关。体外实验、动物实验和离体实验都证实了胄泌素能够通过CCKBR诱导摄取L-DOPA增多,导致多巴胺生成增多,其氨基酸转运机制主要通过LAT1。第二部分：多巴胺D2受体基因单核苷酸多态性诱导人近曲小管细胞发生炎症反应和纤维化背景及目的多巴胺D2受体(D2R)能够反向调节小鼠肾脏近曲小管细胞炎症反应,小鼠D2R功能障碍更容易发生肾脏炎症反应以及纤维化损伤。一些常见的人(h)DRD2基因单核苷酸多态性位点(SNPs;rs6276,6277,and1800497)与D2R表达和功能以及血压调节密切相关,但其是否参于肾脏炎症反应和纤维化并不清楚。我们研究人肾脏近曲小管细胞(HPTCs)携带这些D2RSNPs对十肾脏炎症反应和纤维化损伤的影响,为慢性肾脏疾病和高血压的基因治疗提供新靶点。方法Westernblotting和Real-timePCR方法检测携带D2RSNPsHPTCs和对照组细胞的D2R蛋白和mRNA的表达情况。D2R激动剂刺激细胞后,通过化学发光免疫测定法检测cAMP的生成量,从而观察D2R的功能状态。相同方法方法检测携带D2RSNPsHPTCs和对照组细胞的促炎因子TNFa蛋白和mRNA的表达量,检测细胞因子和趋化因子的表达量。同样通过Westernblotting和Real-timePCR方法检测携带D2RSNPsHPTCs和对照组细胞的促纤维化因子TGFβ1蛋白和mRNA的表达量,以及其信号通路下游因子的表达情况,比如说SMAD3、Snail1、FN-1、Col1a和Vimentin。免疫荧光法检测TGFβ1和下游因子的表达情况,观察细胞形态变化情况。逆向实验向携带D2RSNPsHPTCs瞬时转染人DRD2基因,对照组转染空载体,使得细胞表达足够的D2R。Westernblotting和Real-timePCR方法检测转染后细胞D2R蛋白和mRNA的表达情况。Real-timePCR方法检测转染后细胞TGFβ1和Snail1、FN-1、Col1a和VimentinmRNA的表达量。并且检测TGFβ1和FN-1蛋白表达量。免疫荧光法检测瞬时转染人DRD2基因后TGFβ1和下游因子的表达情况,观察细胞形态变化情况。结果HPTCs携带D2RSNPs与对照组细胞相比较D2R蛋白和mRNA的表达显著降低,功能显著减弱(P<0.05,t-test)。HPTCs携带D2RSNPs与对照组细胞相比较促炎因子TNFα、细胞因子、趋化因子和促纤维化因子TGFβ1以及下游信号靶蛋白Smad3和Snail1的表达显著增加(P<0.05,t-test),出现上皮细胞-间质细胞转化(EMT),并且产生大量细胞外基质蛋白(FN-1、Col1a和Vimentin的表达量增多)。结果表明RPTCs携带D2RSNPs的D2R的表达和功能降低诱导细胞促炎因子和促纤维化因子分泌增加,EMT标志因子分泌增多。为检测D2RSNPs的特异性,向携带D2RSNPs的HPTCs瞬时转染含人DRD2基因的质粒后发现D2R的表达显著升高但并无过表达现象。与对照组相比D2R表达升高诱导TGFβ1,Smad3、Snail1表达均显著降低(P<0.05,t-test),细胞外基质蛋白(FN-1、Col1a和Vimentin)减少。免疫荧光结果也显示细胞出现EMT现象,形状逐渐变为长梭形。结果再次证实了携带有D2RSNPs的人D2R表达和功能均低于正常人,因而更有可能发展肾损伤和肾脏纤维化。结论实验结果表明,D2R有保护人肾脏近曲小管的功能,可以降低炎症因子、促纤维化因子表达,减少EMT标志因子的分泌。但当人体携带有这些D2RSNPs时可能会促进肾脏炎症反应和肾脏纤维化的发展。通过基因检测早发现体内存在的患病风险,早期通过药物干预改善肾纤维化和慢性肾脏病的发展。
【作者】姜晓亮；
【导师】秦川；杨志伟；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学及病理生理学，2014，博士
【关键词】胃泌素；高血压；多巴胺；L-DOPA；L-氨基酸转运体；多巴胺D2受体；单核苷酸多态性；上皮细胞间质细胞转化；肾纤维化；

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