第一部分 自体外周血单个核细胞治疗下肢缺血性疾病的长期疗效及可能的预后因素的分析 第二部分 高糖状态对内皮祖细胞在氧化应激条件下HSF-1表达影响的研究

【摘要】背景：利用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的自体外周血单个核细胞(M-PBMNCs)治疗下肢缺血性疾病的安全性和有效性已经得到证实；然而,关于自体M-PBMNCs治疗下肢缺血性疾病的长期疗效以及可能的预后因素尚待进一步研究。目的：分析自体M-PBMNCs治疗下肢缺血性疾病的长期疗效和可能的预后因素。方法：回顾性分析87例于2002年12月至2011年12月在我院进行自体M-PBMNCs治疗的严重下肢动脉缺血性疾病患者的病历资料,研究变量包括患者初次入院时性别、年龄、Rutherford分级、是否合并其他血管疾病并发症(包括缺血性脑血管疾病和缺血性心脏病)、吸烟史、动员后最高白细胞数、血红蛋白浓度、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原浓度(Fg)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖和细胞治疗次数。然后以电话、门诊和上门访问的方式进行随访。按照是否发生截肢,将患者分为预后良好组(无截肢组)和预后不良组(截肢组)。临床变量非正态分布数据采用利用Mann-Whitney检验进行比较；用χ2检验比较各临床分类变量的截肢率；利用logistic回归方法分析可能提示细胞治疗后截肢的因素。结果和结论：87例患者中,3例患者死亡,1例失访。最终分析的患者人数为83人。患者的疾病类型包括糖尿病下肢缺血性疾病(35例,42.2%)、动脉硬化闭塞症(31例,37.3%)和血栓闭塞性脉管炎(17例,20.5%)。被研究患者的平均年龄为62岁(30-87岁)。中位随访时间为5年。5年的无截肢率为72.2%,未发现自体M-PBMNCS治疗相关的副反应。可能提示预后不良的因素包括：纤维蛋白原>4g/L以及空腹血糖>6mmol/L。研究背景：血管并发症是糖尿病最严重的并发症；目前的研究认为,糖尿病易并发大血管和微血管病变是因为高糖状态下内皮祖细胞的功能受到损伤。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,在胚胎时期以及出生后的血管新生中起着重要作用；在高糖损伤内皮祖细胞功能的机制中,氧化应激发挥重要的作用。而在氧化应激状态下,细胞的一个重要保护机制为热休克因子-1(HSF-1)表达上调,通过热休克蛋白的表达,对细胞起保护作用。但是,目前对于高糖对内皮祖细胞在氧化应激下HSF-1表达的影响,尚无相关报道。目的：观察高糖条件下培养的内皮祖细胞的功能变化；探讨高糖条件下培养的内皮祖细胞在经历氧化应激后HSF-1的表达情况。方法：分离培养正常胎儿脐血来源的内皮祖细胞,并利用流式细胞仪鉴定细胞的表面标记；免疫荧光方法鉴定细胞对Dil-acLDL的摄取能力。然后将培养所得的内皮祖细胞在30mmol/L的高糖条件下培养5天(高糖组),用CCK-8检测内皮祖细胞的增殖功能,用transwell小室检测细胞的迁移功能,同时与无糖EGM-2培养基中培养的内皮祖细胞(对照组)的功能进行比较；然后将高糖组内皮祖细胞在150μmol/L过氧化氢诱导的应激条件下培养6小时,观察处理前后细胞增殖、迁移功能的改变,用实时定量PCR的方法检测过氧化氢处理前后内皮祖细胞内HSF-1mRNA的表达水平,并且与对照组细胞HSF-1mRNA的表达水平进行比较。结果：通过流式细胞仪对细胞表面标记进行检测后发现,脐血分离的单个核细胞在EGM-2培养基中培养10天后,CD34、CD133和KDR的阳性率分别为96.1%,97.6%和96.7%；利用免疫荧光鉴定细胞对Dil-acLDL的摄取能力发现,能够摄取Dil-acLDL的细胞占所有细胞的90%以上,证实为内皮祖细胞。通过CCK-8检测细胞增殖,我们发现高糖组内皮祖细胞的增殖能力弱于对照组,有统计学意义(P=0.025)；利用transwell小室,我们发现,高糖组内皮祖细胞的迁移能力较对照组有所下降,但是无统计学差异(P=0.421)。然而,在经过过氧化氢的短时间处理后,高糖组内皮祖细胞的增殖能力和迁移能力有明显下降,P值分别为0.016和0.024：而对照组细胞在过氧化氢处理前后增殖和迁移能力的下降无统计学差异,P值分别为0.353和0.273。在过氧化氢处理之前,高糖组内皮祖细胞内HSF-1mRNA表达量的中位数为0.162,对照组细胞内HSF-1mRNA表达量的中位数为0.377,两者无统计学差异；在过氧化氢处理6小时后,高糖组和对照组HSF-1mRNA的表达量均有显著升高,P值均<0.05(高糖组为0.982;对照组为1.552)；并且,对照组内皮祖细胞HSF-1mRNA表达量显著高于高糖组内皮祖细胞,P=0.041。结论：高糖状态能够损伤内皮祖细胞的功能；高糖状态下培养的内皮祖细胞在氧化应激条件下更容易出现增殖和迁移能力的下降；在氧化应激条件下,高糖状态下培养的内皮祖细胞HSF-1的表达明显上调,但是仍明显低于对照组内皮祖细胞HSF-1的表达水平。
【作者】孙玲洁；
【导师】黄平平；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】下肢缺血性疾病；细胞治疗；外周血单个核细胞治疗；预后因素；内皮祖细胞；高糖状态；氧化应激；热休克因子-1；

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