组织工程骨构建策略及自体浓缩骨髓血复合支架修复齿槽嵴裂的临床研究

【摘要】目的1.比较三种支架材料β-磷酸三钙(p-TCP)、珊瑚羟基磷灰石(CHA)、冻干同种异体骨(FDBA)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外生物学特性和体内成骨骨量的影响。2.研究不同数量hBMSCs细胞悬液复合β-TCP和CHA支架在体外的生物学特性和TEB体内成骨情况,探讨hBMSCs数量与TEB体内成骨骨量之间的量效关系。3.初步开展应用自体浓缩骨髓血复合β-TCP修复齿槽嵴裂的临床个体化治疗。方法1.应用密度梯度离心结合贴壁法分离培养hBMSCs,并将hBMSCs向成骨细胞、脂肪细胞方向诱导分化。流式细胞技术检测hBMSCs的表面标志物。取P3代hBMSCs在体外构建β-TCP/hBMSCs、CHA/hBMSCs、FDBA/hBMSCs细胞支架复合物,体外成骨诱导2周后植入裸鼠皮下。体外培养的不同时间点检测hBMSCs在支架材料上的粘附、生长、细胞活性、空间分布、基质分泌和成骨相关基因的表达。术后3月取材,Micro-CT和组织学定量检测各组的成骨骨量。2.以β-TCP和CHA为支架材料,使用1μLhBMSCs细胞悬液,不同接种浓度(5×106/mL、10×106/mL、20×106/mL、30×106/mL、50×106/mL)构建TEB,并在体外培养的不同时间点检测hBMSCs在支架材料上的粘附、生长、细胞活性、空间分布、基质分泌和成骨相关基因的表达。体外成骨诱导2周后植入裸鼠皮下,术后3月取材,Micro-CT和组织学定量检测各组TEB的成骨骨量。3.检测自体浓缩骨髓血的生物安全性,明确自体浓缩骨髓血修复骨缺损技术的适应证、禁忌证及可能的风险,制定临床治疗流程并通过伦理委员会、新技术委员会讨论后,于2013年10月至2014年1月,经患者本人或监护人签字同意后,全麻下抽取自体骨髓血,应用密度梯度离心法浓缩骨髓血,复合β-TCP支架修复临床齿槽嵴裂缺损7例,术后不同时间点(3月、6月、1年和2年)行X线和CT检查评价骨缺损修复情况。结果1.hBMSCs在β-TCP组和CHA组的粘附、生长、分布明显优于FDBA组,有统计学差异；FDBA构建的TEB植入体内3月后无新骨生成;β-TCP和CHA构建的TEB体内后可见新骨生成,构建成功率分别为3/4、4/4；成骨面积定量分析结果显示p-TCP组成骨骨量明显高于CHA组。2.以p-TCP为支架构建TEB,接种浓度为10×106/mL及以上浓度时,hBMSCs在p-TCP支架上的生长、活性、分布、基质分泌和成骨分化无显著的统计学差异,但均显著优于5×106/mL组。5×106/mL组在体内无新骨生成；接种浓度为10、20、30和50×106/mL组的TEB体内构建成功率分别为5/7、7/8、6/8和6/8。组织学和Micro-CT定量分析显示30和50×106/mL组TEB的成骨骨量明显高于10和20×106/mL组。因此,采用支架饱和体积(10μL)接种时,TEB达到稳定构建成功率所需的接种浓度是10×106/mL；TEB达到稳定高效成骨的接种浓度是30×106/mL。3.以CHA为支架构建TEB,接种浓度10×106/mL及以上浓度时,hBMSCs在β-TCP支架上的生长、活性、分布、基质分泌和成骨分化无显著的统计学差异,且明显优于10×106/mL组,10×106/mL组又明显优于5×106/mL组。体内TEB样本HE染色结果显示：5×106/mL组无新骨生成；10、20、30和50×106/mL组的TEB体内构建成功率分别为7/8、4/7、6/8和6/8。成骨面积和Micro-CT定量分析显示20、30和50×106/mL组TEB的成骨骨量明显高于10×106/mL组,有统计学差异。因此,采用支架饱和体积(1μL)接种时,构建的TEB达到稳定构建成功率所需的接种浓度是10×106/mL；TEB达到稳定高效成骨的接种浓度是20×106/mL。4.本临床应用研究共纳入7例患者,其中男性2名,女性5名,年龄范围8-27岁。截至2014年2月,全部患者术后均无感染、排斥、外露等并发症出现；其中3名患者术后3月CT复查示骨缺损修复效果良好,其余4名患者仍在随访过程中。结论1.相较于FDBA,β-TCP和CHA支架更适合TEB的构建。2.hBMSCs数量与TEB成骨骨量之间存在量效关系：细胞接种数量低于该支架材料的最低细胞接种量时,TEB植入体内后不能成骨；TEB的成骨骨量随细胞接种数量增加而增加,达到饱和接种量时,TEB体内稳定高效成骨；超过饱和接种量时,TEB成骨骨量无明显增加。3.hBMSCs饱和细胞接种量因支架材料的不同而不同,可能与支架材料本身的特性有关。4.自体浓缩骨髓血复合β-TCP可修复临床齿槽嵴裂。
【作者】吴欢欢；
【导师】曹谊林；
【作者基本信息】北京协和医学院，整形外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】骨组织工程；骨髓间充质干细胞；支架材料；量效关系；自体浓缩骨髓血；

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