小鼠脾组织和脾T细胞亚群的增龄性变化及骨髓间充质干细胞移植对其的影响

【摘要】研究目的1.以健康自然衰老BALB/c小鼠为研究对象,检测青年组(2月龄)、中年组(8月龄)和老年组(20月龄)中小鼠脾脏组织学、干细胞相关转录因子及老化相关转录因子的mRNA表达量的增龄性变化。2.以健康自然衰老的的BALB/c小鼠为研究对象,采用流式细胞术检测青年组(2月龄)、中年组(8月龄)和老年组(20月龄)中小鼠T淋巴细胞亚群的变化。3.分离、培养、鉴定和比较不同年龄段C57BL/6J小鼠骨片来源的骨髓间充质干细胞,为第4部分骨髓间充质干细胞移植实验提供足够的同种异基因骨髓间充干细胞。4.通过尾静脉移植同种异基因骨髓间充质干细胞,观察其对不同年龄段BALB/C小鼠脾脏的影响。方法1.检测BALB/c小鼠脾脏的增龄性变化,共分为3组：青年组(2月龄),中年组(8月龄)和老年组(20月龄),每组各5只。分别取脾脏,观察检测以下内容：(1)脾脏组织学变化,(2)实时荧光定量PCR技术(Real-timePCR)检测脾脏老化相关转录因子AUF1、P16INK4和脾脏干细胞相关转录因子Oct3/4、Sox2、KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt的mRNA表达量的增龄性变化。2.检测BALB/c小鼠脾脏T细胞的增龄性变化,共分为3组：青年组(2月龄),中年组(8月龄)和老年组(20月龄),每组各5只。分别取脾脏,制备脾脏单细胞悬液,用流式细胞仪检测：CD3+、CD4+、CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD441owCD62Lhigh、CD8+CD441owCD62LhighSca-1+的增龄性变化。3.通过骨片消化法从3周龄和22月龄C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨中分离骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs),进行培养扩增。观察培养过程中的细胞形态、并对P6代细胞进行流式检测、成骨诱导及成脂诱导,并比较不同年龄段小鼠BMSC的区别。4.通过尾静脉注射CM-Dil标记的1×107数量同种异基因(C57BL/6J)3周龄小鼠BMSCs,观察其对不同年龄段BALB/c小鼠脾脏的影响。青年注射组(2月龄),中年注射组(8月龄),老年注射组(20月龄),每组各5只小鼠。细胞注射1个月后取小鼠脾脏,进行以下检测：(1)制备脾脏单细胞悬液,流式细胞仪检测：CD3+、CD4+、CD8+、CD8+CD441owCD62Lhigh、CD8+CD441owCD62LhighSca-1+的比例。(2)Real-timePCR仪检测以下老化相关及脾脏干细胞相关转录因子的表达水平：AUF1、P16INK41Oct3/4、Sox2、KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt。将所得结果与第一部分和第二部分同年龄段小鼠的实验结果进行比较,初步探索异基因干细胞注射后对于脾脏的影响。结果第一部分脾脏组织学结果显示：老年组小鼠脾脏组织结构更加紊乱,巨噬细胞和含铁血黄素增多。脾脏组织real-timePCR检测结果显示,老化相关基因P16INK4表达量随增龄性升高,AUF1基因表达量随增龄性下降；脾脏干细胞相关基因Oct3/4、Sox2、KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt的表达量,均随增龄性下降,且青年组(2月龄)和老年组(20月龄)比较,均有显著性差异。第二部分(1)脾脏CD3+T细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是47.8%、50.1%和36.3%。老年组与青年组、中年组相比较,CD3+T细胞比例明显下降,差异均具有统计学意义(p<0.05)。青年组和中年组比较差异均无统计学意义。(2)脾脏中CD4+细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是24.2%、22.7%和21.0%。各组间差异均无统计学意义。(3)脾脏中CD8+细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是17.8%、15.0%和9.8%。老年组分别与青年组、中年组相比较,CD8+T细胞比例明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。青年组和中年组比较差异均无统计学意义。(4)脾脏中CD8+CD28+细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是13.1%、7.3%和6.0%。老年组与青年组、中年组相比较,CD8+T细胞比例明显下降,差异均有高度统计性意义(p<0.001)。青年组和中年组比较无显著性差异。(4)脾脏中CD8+CD44lowCD62Lhigh细胞在脾脏总细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是4.5%、2.2%和3.7%,各组间比较差异均无统计学意义。该细胞在CD8+T细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是24.5%、12.7%和16.5%,各组间比较差异均无统计学意义。(5)脾脏中CD8+CD44lowCD62LhighSca-l+细胞在脾脏总细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是1.4%、1.8%和3.2%,各组间比较差异均无统计学意义。该细胞在脾脏CD8+细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是14.8%、12.6%和26.8%,各组间差异也均无统计学意义。第三部分骨片消化法在10天左右可分离出BMSCs,经过传代后,在P6代可得到纯度较高的BMSCs。P6代细胞进行流式检测CDllb、CD45和CD29。其在不同年龄段小鼠BMSCs中的比例分别为：CD29(3周龄97.97%,22月龄小鼠94.7%)、CDllb(3周龄6.6%,22月龄小鼠8.1%)和CD45(3周龄2.68%,22月龄小鼠2.24%)。两个年龄段P6代细胞均可以成功向成脂和成骨方向诱导。第四部分同种异基因小鼠骨髓间充质干细胞移植后,CD3+和CD8+T细胞在青年组和中年组比例均下降(P<0.005),CD4+T细胞在中年组比例下降(P<0.01)。老年组CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞的比例注射后均未见变化。CD8+CD44lowD62Lhihigh和CD8+CD44lowCD62LhighSca-1+细胞,注射前后比例在各年龄段也均未见变化。Real-timePCR结果显示：细胞注射后对青年组、中年组和老年组脾脏组织脾干细胞相关基因和老化相关基因可产生影响,且在不同年龄段产生的影响不一样。结论1.利用骨片消化法可得到质量较高的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,通过其细胞生物学特性观察、流式细胞术检测和多向诱导分化可证明其符合骨髓间充质干细胞(BMSCs)的标准,可应用于进一步的细胞治疗实验要求。且不同年龄段小鼠的BMSC的生长状态及分化潜能有区别。2.BALB/c小鼠脾脏组织和脾T淋巴细胞亚群具有增龄性的变化。同种异基因骨髓间充质干细胞移植后,可对脾脏组织和脾T淋巴细胞亚群产生影响,且在不同年龄段效果不同。本研究的创新点1.AUF1目前被报道的唯一可同时调控炎症、衰老和癌症的单一基因。本实验中首次对AUF1在小鼠脾脏内的增龄性变化进行了检测,发现AUF1的表达量出现了随增龄性下降的趋势。2.首次在普通小鼠体内对脾脏记忆性T细胞中的干性标记Sca-1进行了增龄性变化检测,结果显示,CD8+CD44l0CD62LhiSca-1+未出现增龄性变化。3.首次报道了脾脏干细胞相关转录因子(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt)的增龄性变化。结果显示,这9个转录因子均出现了增龄性下降的趋势。4.通过移植同种异基因骨髓间充质干细胞,检测其在不同年龄段中对脾脏干细胞相关转录因子及老化转录因子AUF1的影响。结果表明,干细胞注射后会对某些基因的表达产生影响,且在不同年龄段小鼠的影响不同。
【作者】周碧玉；
【导师】赵振民；
【作者基本信息】北京协和医学院，外科学，2014，博士
【关键词】衰老；脾脏；T淋巴细胞；骨髓间充质干细胞；细胞治疗；

【参考文献】
[1]杨俊凯.治理、摆平与抗争[D].华中师范大学,政治学理论,2004,硕士.
[2]李婕.Turner综合征患儿生长激素受体外显子3多态性与生长激素疗效相关性分析[D].华中科技大学,儿科学,2013,硕士.
[3]牛卉.基于F1000的同行评议分析[D].第四军医大学,图书馆学,2013,硕士.
[4]张金娥.带阻尼项的可压缩欧拉方程组的经典解[D].华东交通大学,应用数学,2012,硕士.
[5]黄振宇.政府投资项目管理问题研究[D].广西师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[6]徐德威.吉林省西部农村敬老院发展问题研究[D].长春工业大学,社会保障,2013,硕士.
[7]董玉香,李禧婧,刘刚.基于空间句法的地铁站换乘空间可达性初探——以北京西直门地铁2号线换乘空间为例[J].华中建筑,2015,06:72-77.
[8]钟世名.基于能值—生态足迹理论的生态经济系统评价[D].吉林大学,地质工程,2013,硕士.
[9]曹立杰.中国城市化进程中的逆城市化现象研究[D].河北师范大学,政治经济学,2012,硕士.
[10]王琛.以聚酯类材料为载体的阿司匹林/环糊精药物控制释放体系的研究[D].浙江大学,高分子化学与物理,2004,硕士.
[11]陈晓伟.基于模块化的国家电网公司企业文化落地研究及应用[D].重庆大学,工业工程,2014,硕士.
[12]何煦.黄河沿岸少数民族地区生态景观保护与改善的设计研究[D].西安建筑科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[13]章潇.西部地区高等教育与区域经济互动发展关系研究[D].广西师范大学,高等教育学,2013,硕士.
[14]乔群.祭奠权的法律保护[D].沈阳师范大学,法律,2014,硕士.
[15]周康,王艳阳,毛汉平.异机种数据通信在板坯连铸机自控系统中的实现[J].冶金自动化,1998,01:26-28+51.
[16]张子凡.流浪儿童救助中政府与民间组织的合作机制研究[D].华东理工大学,社会保障,2013,硕士.
[17]张燕,张敏,陈妹琼,蔡志泉,孙二双,程发良.基于咪唑盐离子液体固定GO_x于Au/石墨烯复合材料电极表面的葡萄糖酶传感器研究[J].分析试验室,2014,06:659-663.
[18]黄龙.有机太赫兹敏感材料的合成与特性研究[D].电子科技大学,2013.
[19]洪悦.汽车广告对中国汽车消费文化的影响[D].东北师范大学,新闻学,2012,硕士.
[20]孙叶文.论刑法中的被胁迫行为[D].苏州大学,刑法学,2014,硕士.
[21]王亚男.高师体育教育专业学生职业技能培养调查分析[D].湖南师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[22]蒋鸣雷,郑士振,郭伟.基于ANSYS的越野车车架有限元分析[J].冶金自动化,2012,04:57-59+75.
[23]余从津.非线性维数约减的研究及其应用[D].天津大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[24]刘金龙.基于Wiki的数据库课程可执行案例支撑环境的设计与实现[D].国防科学技术大学,软件工程,2012,硕士.
[25]刘荣.移动Ad hoc网络基于链路稳定性的路由算法研究[D].湖南大学,信息与通信工程,2012,硕士.
[26]袁保山.大型汽轮机汽缸的机械加工[J].发电设备.1993(Z3)
[27]夏万军.智能控制及可视化技术在充电机中的应用研究[D].合肥工业大学,2005.
[28]朱蕾.境惟幽绝尘，心以静堪寄[D].天津大学,建筑历史计及其理论,2004,硕士.
[29]钟萌萌.倾听教学下和谐师生关系研究[D].吉林大学,课程与教学论,2014,硕士.
[30]王志毅.凹叶厚朴再生体系构建及愈伤组织总酚含量变化研究[D].中南林业科技大学,植物学,2013,硕士.
[31]陈一新.后危机时期高风险金融交易法律规制的国际法分析[J].法制博览(中旬刊).
[32]鲁丽波.鄂尔多斯市土地生态状况调查与评估分析[D].内蒙古师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[33]姚洁青.汉日拟声词比较研究[D].上海师范大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[34]张敏.论肺与大肠的“相合”与“相表里”[D].福建中医药大学,中医基础理论,2013,硕士.
[35]张紫萍,刘秀军,李同起,胡子君.掺杂型石墨烯基纳米复合材料的研究进展[J].化工进展,2011,04:788-792+806.
[36]章周梁.不同类型疝修补网片在大鼠体内的变化以及对大鼠生殖功能影响的对比实验研究[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[37]成剑波,李卫东,何茂平.宽带运维系统建设模式的探讨[J].世界电信.2004(02)
[38]姜辉.中学英语交际法教学的反思与实践[D].东北师范大学,教育,2003,硕士.
[39]杨春香.镉对姬松茸菌丝生长的影响[D].福建师范大学,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[40]班洁静.土壤含水量、pH、Ca~(2+)浓度对芸薹根肿菌侵染及发病影响研究[D].华中农业大学,植物病理学,2014,硕士.
[41]马俊文.安德生菊石科的新材料[J].江西地质科技.1995(03)
[42]张长喜.应用POSSUM评分系统判断胸外科患者是否需要术后直接转入ICU[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[43]宋茜.FoxO基因在昆虫蜕皮中的功能研究[D].山东大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[44]朱亮,陆静雅,左万利.基于用户搜索行为的query-doc关联挖掘[J].自动化学报,2014,08:1654-1666.
[45]王旭禛.褪黑素对慢性间歇性缺氧心肺保护作用[D].桂林医学院,外科学,2012,硕士.
[46]张继红.肾上腺素对体外培养染铝大鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响[D].东北农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[47]朱海燕.日英同盟在日本侵华史上的影响[D].吉林大学,世界史,2004,硕士.
[48]李阳.农业科技服务体系建设视阈下的农村专业合作组织发展研究[D].中南民族大学,行政管理,2013,硕士.
[49]刘威.城市空间的叙事性设计方法研究[D].青岛理工大学,建筑设计及其理论,2012,硕士.
[50]贺电.大型风电场短期功率预测研究[D].北京交通大学,2011.