microRNA-26a通过干预PTEN相关通路影响创面愈合的机制研究

【摘要】目的：实验一：1、观察慢病毒载体转染HaCaT效率,构建miR-26a转染细胞株模型的可能性；2、比较转染miR-26a促进剂和抑制剂对HaCaT细胞增殖能力的影响；3、比较转染miR-26a促进剂和抑制剂对HaCaT细胞迁移能力的影响；4、比较转染miR-26a促进剂和抑制剂对HaCaT细胞PTEN/AKT/GSK3β通路相关因子表达的影响。实验二：1、比较正常氧和乏氧条件下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的mir-26a的表达变化；2、比较正常氧和乏氧条件下HUVECsPTEN基因的表达变化；3、比较正常氧和乏氧条件对HUVECsPTEN/AKT/VEGF通路相关因子表达的影响。实验三：1、观察局部应用miR-26a抑制剂对小鼠创面组织miR-26a表达的影响；2、观察局部应用miR-26a抑制剂对小鼠创面愈合速度和愈合质量的影响。实验四：1、观察与正常C57小鼠相比db/db糖尿病小鼠创面局部miR-26a的表达变化；2、观察局部应用miR-26a抑制剂对糖尿病小鼠创面组织miR-26a表达的影响；3、观察局部应用miR-26a抑制剂对糖尿病小鼠创面愈合速度和愈合质量的影响。方法：实验一：构建慢病毒载体,转染293T细胞获得稳定表达miR-26a的慢病毒。用构建好的miR-26a慢病毒感染HaCaT细胞,建立了miR-26a表达增强或抑制的细胞模型。采用CCK8试剂盒对检测细胞的生长情况,划痕试验检测细胞的侵袭转移能力。采用RT-PCR和Westernblot技术分别在mRNA和蛋白表达水平上检测不同组细胞PTEN/AKT/GSK3β通路相关因子的表达情况。实验二：用三气培养箱构建常氧及乏氧环境,体外培养HUVECs细胞48小时。采用RT-PCR检测两组细胞miR-26a和PTEN的表达差异,Westernblot技术在蛋白表达水平上检测不同组细胞PTEN/AKT/VEGF通路相关因子的蛋白表达情况。实验三：制作小鼠全层皮肤缺损创面模型,设为miR-26a抑制剂组和对照组,对创面愈合速度、肉芽组织厚度、表达CD31的新生血管、表达Ki67的增殖期细胞数进行统计学比较。实验四：制作糖尿病小鼠和C57小鼠全层皮肤缺损创面模型,设为C57非糖尿病组和糖尿病组,检测局部miR-26a的表达。制作糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面模型,设为miR-26a抑制剂组和对照组,对创面愈合速度、肉芽组织厚度、表达CD31的新生血管进行统计学比较。结果：实验一：建立了miR-26a表达增强或抑制的细胞模型,72小时在荧光显微镜下对荧光阳性细胞进行计数,转染效率高达90%以上。在培养24h后,转染miR-26a抑制剂组的OD值便显著高于其他各组(p<0.05),转染miR-26a促进剂组的OD值在培养48h后显著低于其他各组(p<0.05)。从24h起,转染miR-26a抑制剂组细胞的划痕宽度就明显小于其它组,该组细胞迁移能力明显增强(P<0.01)。在48h时,转染niR-26a抑制剂组细胞的划痕区域愈合。RT-PCR结果显示转染mir-26a抑制剂细胞组中PTEN的表达与其他组的差异具有显著性(P<0.05)。Westernblot结果显示,与其他组相比,抑制剂组β-catenin和AKT蛋白表达明显升高,PTEN和GSK3β蛋白明显降低。实验二：培养48小时后,两种方法处理后,乏氧组细胞株中miR-26a和PTEN的表达交常氧组明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。Westernblot结果显示,与常氧组相比,乏氧组HIF-1、VEGFAKT蛋白表达明显升高,PTEN蛋白明显降低。实验三：miR-26a抑制剂组较对照组创面愈合速度明显加快。术后第10天,miR-26a抑制剂组创面肉芽组织厚度为对照组的2倍(P<0.05)每张切片内CD31阳性新生血管数分别为65.0±11.7和33.5±13.0(P<0.05),Ki67阳性细胞总数占细胞总数百分比分别为69.5±15.7和46.3±14.0(P<0.01)。差异均有统计学意义。实验四：创面模型建立后3天,db/db组miR-26a表达水平是C57组的2.0倍(P<0.05)术后第10天,miR-26a抑制剂组创面肉芽组织厚度为对照组的2.3倍(P<0.05),每张切片内CD31阳性新生血管数分别为47.8±13.2和30.5±6.6(P>0.05)。结论：实验一：1、利用慢病毒载体转染HaCaT,可以构建成功而稳定的miR-26a转染细胞株模型；2、转染miR-26a抑制剂后HaCaT细胞增殖能力较转染miR-26a促进剂细胞和空白组明显增强；3、转染miR-26a抑制剂后HaCaT细胞迁移能力较转染miR-26a促进剂细胞和空白组明显增强；4、转染miR-26a抑制剂后HaCaT细胞PTEN的表达明显降低,miR-26a可能通过调控PTEN/AKT/GSK3β通路相关因子的表达影响细胞生物活性。实验二：1、乏氧条件可以抑制HUVECs的mir-26a的表达；2、在乏氧条件下HUVECsPTEN基因的表达明显下降；3、乏氧条件可能通过miR-26a调控PTEN/AKT/VEGF通路相关因子的表达进一步影响细胞生物活性。实验三：1、局部应用miR-26a抑制剂可明显降低小鼠创面组织miR-26a的表达；2、局部应用miR-26a抑制剂可明显增加小鼠创面的肉芽组织厚度、新生血管数量和增殖细胞比例,从而促进创面的愈合速度。实验四：1、与非糖尿病小鼠比糖尿病小鼠创面局部miR-26a表达明显增多；2、局部应用miR-26a抑制剂可明显降低糖尿病小鼠创面组织miR-26a的表达；3、局部应用miR-26a抑制剂可明显增加糖尿病小鼠创面的肉芽组织厚度、新生血管数量和增殖细胞比例,从而促进创面的愈合速度。
【作者】俞楠泽；
【导师】王晓军；
【作者基本信息】北京协和医学院，整形外科（专业学位），2014，博士
【关键词】miR-26a；PTEN；人永生化皮肤角质形成细胞；人脐静脉内皮细胞；创面愈合；糖尿病；

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