长链非编码RNA MALAT1在胰腺导管腺癌中的表达及功能研究

【摘要】胰腺导管腺癌(PDAC)在世界范围内是死亡率最高的恶性肿瘤之一,在过去的三十年,PDAC患者的预后没有明显改善,五年生存率只有6%。近年来长链非编码RNA(lncRNAs)是研究的热点,lncRNA的突变及异常表达与包括肿瘤在内的多种人类疾病有密切联系,但lncRNAs在胰腺癌中的作用尚不清楚。本课题通过分析胰腺导管腺癌表达谱数据,筛选在胰腺癌中差异表达且可能与患者预后相关的lncRNAs。我们从Pubmed基因表达文库(GEO)数据库筛选出3个高质量的胰腺癌表达芯片数据,分析差异表达基因。选取在三个表达谱数据中表达变化一致的lncRNAs,根据胰腺癌患者各个差异lncRNA表达水平和患者生存资料,分析其是否影响预后。在筛选出的lncRNAs中,研究已经发现lncRNAMALAT1(metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1)在非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤中表达上调,且与总生存时间负相关,而其在胰腺癌中发挥的作用未知,因此本课题将重点研究MALAT1在胰腺癌中的表达及功能。研究表明lncRNAs可以受到microRNA(miRNA)的调控,机制与调控蛋白编码基因类似,因此,我们将研究胰腺癌中的muRNA是否可以调控MALAT1。分析表达谱数据发现,与癌旁组织相比MALAT1在PDAC组织中高表达,并且在转移发生后,表达水平进一步升高；与永生化胰腺导管上皮细胞HPDE相比MALAT1在20种PDAC细胞系的表达水平均有不同程度的上调。将GSE21501胰腺癌患者根据MALAT1表达水平分为MALAT1高表达组(高15%)和低表达组(低85%),Kaplan-Meier生存分析结果显示,与MALAT1高表达组相比,低表达组术后生存时间更长,两组术后中位生存时间分别是19个月95%CI[15.6,22.4]和13个月95%CI[7.9,18.0],Log-rank检测差异有统计学意义(p=0.0014)。通过分析MALAT1高表达组及低表达组的差异表达基因,做基因功能分析,发现上调表达基因主要与正向调控细胞生长/增殖、负向调控细胞死亡/凋亡、细胞定位及代谢等生物学过程相关。MALAT1基因位于11q13.1,其临时转录本长8708bp,共有4种不同的剪接形式。在转录后水平,MALAT1RNA3’端经RNaseP和RNaseZ剪接修饰产生一条长61nt的tRNA样分子,被分泌至胞浆,称为nascRNA。在胰腺癌细胞系及组织中用qPCR和ISH实验验证MALAT1的表达水平,发现与HPDE细胞相比,MALAT1在ANC1、AsPC1及BxPC3细胞中均表达上调,这与PDAC细胞系表达谱数据结果一致。与癌旁正常组织相比,MALAT1在PDAC组织肿瘤细胞核中表达上调。Northernblot实验用一段MALAT1的反义RNA为探针检测到两个MALAT1条带,长转录本位于相当于MALAT1全长转录本的位置,另一条短转录本长度在28SRNA(4700nt)与18SRNA(1900nt)之间。胰腺癌细胞系中长转录本的丰度要高于短转录本。我们用RNAi技术敲低胰腺癌PANC1和AsPCl细胞中MALAT1表达水平,分别用CCK-8、EdU实验、集落形成实验、细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验和流式细胞术证实敲低MALATl可以抑制细胞增殖、抑制细胞的迁移和侵袭能力、诱导细胞发生G0/G1到S期阻滞和促进细胞凋亡。MALAT1敲低PANC1细胞的小鼠移植瘤生长缓慢。转染miR-217mimic可以下调MALAT1RNA表达水平。采用qPCR技术同时检测miR-217及MALAT1在7种胰腺癌细胞系：PANC1、AsPC1、BxPC3、MIAPaCa2、P3、P4、P7及永生化胰腺导管上皮细胞系HPDE中的表达,经Kendall’stau-b相关分析发现,miR-217和MALAT1的表达之间存在负相关关系。构建包含miR-217结合位点的MALAT1片段的pmirGLO双荧光素酶报告基因载体,报告基因实验显示过表达miR-217使pmirGLO-MALATl-WT报告基因的荧光素酶活性降低,将miR-217结合位点突变后,降低荧光素酶活性作用消失；说明niR-217是通过MALAT1的miR-217结合位点发挥直接调控作用。实验室前期研究发现miR-217可以直接靶向调控KRASmRNA,提示KRAS与MALAT1可能为竞争性内源性RNA。Westernblot实验发现敲低MALAT1可以下调KRAS蛋白表达并且下调pRL-TK-KRAS-3’UTR-WT报告基因载体荧光素酶活性。证实MALAT1是通过竞争结合niR-217来调控KRAS蛋白质表达。综上所述,MALAT1在胰腺癌细胞系及组织中高表达,敲低MALAT1抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞周期发生G0/G1到S期阻滞,抑制细胞迁移侵袭。MALAT1是miR-217的一个新的靶基因,并且通过miR-217影响KRAS蛋白水平。提示MALAT1可能在胰腺癌的发生发展过程中发挥重要作用,本研究可能为胰腺癌的诊断和靶向治疗提供新的线索。
【作者】刘平平；
【导师】陈杰；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】胰腺癌；MALAT1；miR-217；

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