低分子量聚乙烯亚胺衍生物的合成、筛选及其在乳腺癌基因治疗中的应用

【摘要】乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤。现有的手术切除、激素疗法、放化疗等方法治疗乳腺癌的疗效有限,恶性或复发性乳腺癌的治愈率不足5%。由于肿瘤异质性和肿瘤基因组的不稳定性,传统方法中采用单一靶点治疗肿瘤的有效性无法长期保持,肿瘤基因疗法应运而生。在众多肿瘤基因疗法中,借助RNAi技术,我们可以沉默肿瘤细胞中的任意多种特定突变基因或过表达基因,实现抗肿瘤的个体化治疗。然而,如何实现基因药物安全有效的体内递送是基因治疗的一大技术瓶颈。因此,我们分别对小分子量分枝状PEI(bPEI1800)和直线型PEI(1PEI2200)进行烷基化修饰,并进一步进行二硫键交联,分别合成得到了4大类PEI衍生物。通过考察这4大类PEI衍生物的理化性质、细胞毒性、递送质粒DNA的体内外转染效率、递送siRNA的靶基因沉默效率,我们从中筛选出了较好的DNA递送载体(1PEI2200-SS口PEI2200-C12-5.28-SS)和siRNA递送载体(bPEl1800-C12-19.72和1PEI2200-SS)。鉴于survivin在乳腺癌中过表达,且survivin的过表达在乳腺癌的发生、发展、转移和预后等方面均发挥了重要作用,我们进一步考察了IPEI2200-SS递送靶向survivin的siRNA(siRNAsur)的体内外抗乳腺癌效果。在本论文的第二章中,我们采用十二烷基接枝低分子量bPEI1800,合成得到了一系列不同烷基取代度的bPEI1800-C12。bPEI1800-C2对4T1和MCF-7细胞的毒性较低。两亲性的bPEI1800-C12在水溶液中可以自组装成核-壳型胶束状粒子。bPEI1800-C12/DNA复合颗粒能够抵抗高浓度阴离子的置换,表现出很高的稳定性。烷基化修饰增强了bPEI1800-C12对细胞膜的亲和力,因而bPEI1800-C12/DNA复合颗粒的细胞摄取大大增加,且bPEI1800-C12/DNA复合颗粒的胞吞主要由小窝蛋白介导,可以避免溶酶体降解。在各bPEI1800-C12中,bPEI1800-C12-19.72的转染效率最高,bPEI1800-C12-19.72/DNA复合颗粒体外转染4T1细胞的能力与市售转染试剂lipofectamine2000相当,并显著强于IPEI22K。用bPEI1800-C12-19.72递送pGL4.50可以在小鼠体内高效表达荧光素酶,且荧光素酶主要在小鼠的肝脏、脾脏和肾脏表达。在本论文的第三章中,我们在bPEI1800和bPEI1800-C,2的基础上进一步合成得到了二硫键交联的bPEI1800-SS和bPEI1800-C12-SS。我们发现二硫键交联增大了bPEI1800-C12-SS对4T1细胞的毒性,而bPEI1800-C12-SS对MCF-7细胞的毒性与bPEI1800-C12相当。在bPEI1800-SS和各bPEI1800-C12-SS中,DNA递送效率最高的是bPEI1800-C12-25-SS,即bPEI1800-C12的烷基取代度为25,且二硫键交联反应中,硫化丙烯与bPEI1800-C12-25的摩尔比为5：1。在本论文的第四章中,我们采用酸水解法,以PEOZs为前体,合成得到了分子量为2200的直线型PEI(1PEI2200),并进一步采用十二烷基接枝IPEI2200合成得到不同烷基取代度的lPEI2200-C12。与lPEI2200相比,烷基化修饰增大了1PEI2200-C12对4T1细胞的毒性,而1PEI2200-C12对MCF-7细胞的毒性与1PEI2200相当。我们发现lPEI2200-C12的基因递送效率与烷基取代度呈负相关,低烷基取代度的1PEI2200-C12-5.28具有较高的基因转染效率,而高烷基取代度(>12.5)的1PEI2200-C12的基因转染效率甚至比1PEI2200低。在各1PEI2200-C12中,优选的DNA递送载体是烷基取代度为5.28的1PEI2200-C12-5.28。在本论文的第五章中,我们在lPEI2200和lPEI2200-C12的基础上进一步进行二硫键交联,合成得到了1PEI2200-SS和1PEI2200-C12-SS。我们发现二硫键交联降低了1PEI2200-C12-SS对4T1的毒性,1PE12200-C12-SS对MCF-7细胞的毒性与1PE12200-C12相当。1PE12200-C12-SS固缩DNA的能力比1PE12200-C12强。在1PE12200-SS和各1PE12200-C12-SS中,递送DNA转染4T1细胞效率最高的是1PE12200-C12-5.28-SS；递送DNA转染MCF-7细胞的最佳递送载体是1PE12200-SS。通过第二章至第五章的研究,我们从4大类PEI衍生物中初选了5种较好的PEI衍生物：bPEI1800-C12-19.72、bPEI1800-C12-25-SS、1PEI2200-C12-5.28、1PEI2200-SS、1PEI2200-C12-5.28-SS。在本论文的第六章中,我们平行考察了这5种初选PEI衍生物递送质粒DNA转染4T1、MCF-7和B16细胞的效率,从中优选出了2种较好的DNA递送载体：1PEI2200-SS和1PEI2200-C12-5.28-SS,且PEI2200-C12-5.28-SS递送pGL4.50在小鼠体内的表达效率比lPEI2200-SS高。我们发现PEI衍生物的修饰方法、聚合物与DNA的复合质量比、细胞种类均对PEI衍生物的基因递送效率有显著影响。在本论文的第七章中,我们平行考察了前述5种初选PEI衍生物递送siRNA沉默luciferase靶基因的效率,从中优选出了两种较好的siRNA递送载体：lPEI2200-SS和bPEI1800-C12-19.72,其中,1PEI2200-SS略优于bPEI1800-C12-19.72,且两者的靶基因沉默效率均比lipofectamine2000高。在二硫键还原剂DTT存在的条件下,1PEI2200-SS中的二硫键可以被还原断裂,1PEI2200-SS/siRNA复合颗粒中的siRNA可以被有效释放。1PEI2200-SS/siRNAsur具有很强的诱导细胞凋亡、抑制4T1细胞增殖的能力。瘤内注射给予1PEI2200-SS/siRN[Asur可以有效抑制荷4T1小鼠肿瘤模型的肿瘤生长、肿瘤的肺脏和肝脏转移。
【作者】柳珊；
【导师】高钟镐；
【作者基本信息】北京协和医学院，药剂学，2014，博士
【关键词】聚乙烯亚胺；小干扰RNA；生存素；二硫键交联；烷基化；乳腺癌；

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