盐酸关附甲素对SCN5A基因突变中晚钠电流的作用评价

【摘要】第一部分盐酸关附甲素对SCN5A基因突变中晚钠电流的短期作用及机制研究目的晚钠电流异常增强与多种疾病的发生发展高度相关,抑制晚钠电流成为抗心律失常药物作用的新靶点。盐酸关附甲素是我国自主研发的一类抗心律失常新药,是一种以钠通道阻滞为主的多离子通道抑制剂。本实验旨在评价盐酸关附甲素对晚钠电流的作用,并进一步明确其抗心律失常的作用机制。方法通过瞬时转染的方法分别将野生型和两种导致晚钠电流增加的SCN5A基因突变(△KPQ-SCN5A突变和F1473S-SCN5A突变)的质粒转染进人胚肾细胞(HEK293),采用全细胞膜片钳技术评价盐酸关附甲素对钠电流和晚钠电流的作用,及其对钠通道动力学的影响。结果与野生型相比,△KPQ-SCN5A突变和F1473S-SCN5A突变中均有晚钠电流的异常增强。100μmol/L的盐酸关附甲素对峰钠电流(lpeak)、复极150ms处和复极600ms处的晚钠电流(lsus)均有抑制作用,且对晚钠电流的抑制作用大于其对峰钠电流的抑制。尤其是在F1473S突变体中,盐酸关附甲素对晚钠电流的抑制是其对峰钠电流抑制的4.6倍。盐酸关附甲素使△KPQ突变体稳态失活曲线左移,通道失活后恢复过程减慢,对稳态激活曲线无影响；使F1473S突变体稳态失活曲线左移,但不改变通道激活和失活后恢复时间。结论盐酸关附甲素主要作用于钠通道的失活态,对峰钠电流和晚钠电流均有抑制作用,且对晚钠电流的抑制大于其对峰钠电流的抑制,尤其是在晚钠电流异常增强的病理情况下,其对晚钠电流的抑制作用更强,对晚钠电流的抑制是盐酸关附甲素抗心律失常作用的机制之一。第二部分盐酸关附甲素对SCN5A基因突变中晚钠电流及钠通道蛋白的长期作用及机制评价目的SCN5A基因突变中存在重叠表型(OverlappingSyndrome)的现象,即一种SCN5A基因突变可以同时导致多种临床表型。研究发现,在有重叠表型的LQT3患者中,兼有钠通道的“功能获得”和“功能缺失”两种机制,表现在除了有晚钠电流异常增强及门控通道特性的改变之外,往往还伴有通道蛋白的转运和表达异常。本实验在伴或不伴通道蛋白转运障碍的突变中评价盐酸关附甲素对SCN5A基因突变电流和通道蛋白的长期作用,进一步阐明其抗心律失常的作用机制。方法利用瞬时转染的方法分别将野生型、△KPQ-SCN5A突变和F1473S-SCN5A突变的质粒转染进人胚肾细胞(HEK293),并在100μmol/L盐酸关附甲素的环境中孵育48小时。采用全细胞膜片钳技术评价盐酸关附甲素对钠通道电流的影响,应用免疫荧光(Immunofluorescence)和免疫蛋白印迹(WesternBlot)来评价药物对钠通道蛋白在细胞膜和胞浆内分布及含量的影响。结果1.盐酸关附甲素孵育48小时后,△KPQ突变的峰钠电流及晚钠电流密度均降低,且晚钠电流降低的幅度大于峰钠电流,盐酸关附甲素孵育使得钠通道稳态失活曲线失活左移,对稳态激活曲线及失活后恢复曲线无明显影响；△KPQ突变中无蛋白转运障碍,免疫荧光和蛋白印迹实验显示,孵育后△KPQ突变体的细胞膜表面蛋白分布较前无明显差异,药物孵育对细胞膜表面及胞质内的蛋白含量无明显影响。2.盐酸关附甲素孵育48小时后,F1473S突变体峰钠电流与晚钠电流密度都增加,尤以峰钠电流为著,稳态激活曲线左移,半激活电压减小,稳态失活曲线及失活后恢复曲线无明显变化。免疫荧光和蛋白印迹实验显示F1473S突变体细胞内存在蛋白转运和表达障碍,盐酸关附甲素孵育可以改善和逆转F1473S突变通道蛋白转运障碍,使得胞膜表面蛋白分布明显增多、含量增加。在孵育后洗脱药物,峰钠电流和晚钠电流密度均增加,尤以晚钠电流增加为主,稳态失活曲线右移。说明盐酸关附甲素对F1473S突变体作用体现在对钠电流的抑制和对蛋白转运障碍的拯救两个方面,对蛋白转运障碍的改善引起的晚钠电流增加超过了盐酸关附甲素对钠电流的抑制作用,净效应表现为峰钠电流和晚钠电流均有增加。结论1.在无通道蛋白转运障碍的△KPQ突变中,盐酸关附甲素可以选择性抑制晚钠电流,且对通道蛋白转运及表达无明显作用。2.在有通道蛋白转运障碍的F1473S突变中,盐酸关附甲素长期作用可以改善通道蛋白转运障碍,使得细胞膜表面的蛋白增加、钠通道密度增加,最终结果导致晚钠电流增大。
【作者】邵兴慧；
【导师】杨艳敏；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2014，博士
【关键词】SCN5A基因；长QT综合征3型(LQT3)；盐酸关附甲素；晚钠电流；膜片钳；免疫荧光(Immunofluorescence)；免疫印迹(WesternBlot)；

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