脑源性神经营养因子和前体在胶质瘤中的生物学作用

【摘要】目的1.中枢神经系统同时存在着两种形式的BDNF——proBDNF和matureBDNF。BDNF基因先编码proBDNF,经过一系列细胞内和细胞外蛋白酶的作用,裂解形成matureBDNF。ProBDNF和matureBDNF通过两个不同的跨膜受体信号系统——p75NTR和rrkB介导不同的生物学作用。与natureBDNF的作用相反,proBDNF和]p75NTR及其共受体sortilin高亲和力结合,诱导凋亡、长时程抑制、突触回缩、轴突溃变。BDNF信号转导可以被恶性细胞“劫持”,为己所用。2.尽管有大量研究表明,BDNF及其受体TrkB在恶性肿瘤表达显著上调,通过自分泌或旁分泌机制促进肿瘤生长和恶性转化。由于使用的是非特异性的BDNF抗体或ELISA检测,这些研究并没有区分proBDNF和matureBDNF。胶质瘤占颅内肿瘤大约40%,胶质瘤的起源及其生物学特点提示大脑为胶质瘤的生长提供了特殊的微环境。高级别胶质瘤无法治愈,且生存期短、预后差。源自人恶性胶质瘤的24个细胞系中,都存在BDNF的广泛表达,提示BDNF对胶质瘤的生物学行为可能有重要作用。3.已经证明p75NTR在人高级别胶质瘤中表达上调,proBDNF是p75NTR的主要配体,推测proBDNF和matureBDNF共存于胶质瘤细胞,proBDNF-p75NTR通路和matureBDNF-TrkB通路可能同时影响胶质瘤的生物学行为,其作用可能相反。4.本研究使用的高特异性抗proBDNF抗体和抗matureBDNF抗体能够区分proBDNF和matureBDNF,第一次系统地探索了proBDNF及其受体p75NTR和sortilin在不同恶性级别的人胶质瘤中的表达。第一次用特异性的抗体测定proBDNF和matureBDNF的比率在不同级别人胶质瘤中的变化。为了证明proBDNF和matureBDNF对胶质瘤细胞的生物学作用的差异,用C6胶质瘤细胞作为体外实验模型,探索了proBDNF和natureBDNF对C6胶质瘤细胞的生长、分化、侵袭性的生物学作用和可能机制。方法1.本研究收集了不同恶性级别的人胶质瘤样本(n=52)和正常人脑组织样本(n=13),通过免疫组织化学、实时荧光定量PCR、Westernblot和ELISA多种方法,检测proBDNF及其高亲和力受体p75NTR阳sortilin的表达,检测matureBDNF及其主要受体TrkB的表达。用荧光免疫双标的方法,分析proBDNF/p75NTR、proBDNF/sortilin、matureBDNF/TrkBI的不同亚细胞定位。研究分析了proBDNF和matureBDNF及其受体和胶质瘤恶性级别的相关性,并第一次分析了proBDNF/matureBDNF比率与胶质瘤恶性级别的相关性。2.检测大鼠C6胶质瘤细胞系表达proBDNF、matureBDFN及其受体,以此细胞系为模型进行体外实验,探索proBDNF和matureBDNF对C6胶质瘤细胞的分化、生长、凋亡和侵袭的影响。对C6细胞分别采取不同处理：(1)加入不同浓度的抗裂解的重组proBDNF蛋白(1,3,10，30ng/mL);(2)加入不同浓度的重组matureBDNF蛋白(1,3,10,30ng/mL);(3)加入特异性抗proBDNF抗体(1,3,10μg/mL)中和内源性proBDNF;(4)加入特异性抗matureBDNF抗体(1,3,10μg/mL)中和内源性matureBDNF;(5)加入p75NTR-ECD-Fc(5μg/mL)阻断p75NTR作用。观察不同处理后C6细胞形态和胶质细胞标志物GFAP的表达变化；MTT法测定C6细胞增殖；DAPI核染色法检测C6细胞凋亡；划痕实验和细胞侵袭小室法测定C6细胞的侵袭性。结果1.ProBDNF,p75NTR和sortilin表达在高级别胶质瘤中明显上调,proBDNF/p75NTR,proBDNF/sortilin在胶质瘤细胞中共表达,并且存在不同的亚细胞分布,proBDNF在胶质瘤细胞浆和细胞核中都有表达。相关分析显示proBDNF、p75NTR、sortilin都与胶质瘤肿瘤恶性程度正相关。2.ProBDNF和matureBDNF共同表达在人胶质瘤细胞中,proBDNF/matureBDNF比率在高级别胶质瘤中明显降低,与胶质瘤恶性级别呈负相关。3.体外实验结果表明,(1)重组proBDNF蛋白引起了C6细胞的形态变化,并通过p75NTR上调了C6细胞GFAP表达,而proBDNF抗体明显下调了C6细胞GFAP表达。重组proBDNF蛋白通过p75NTR促进了C6细胞凋亡,抑制了C6细胞的增殖、迁移和侵袭；而proBDNF抗体抑制了C6细胞凋亡,促进了C6细胞增殖、迁移和侵袭,其效应呈剂量依赖性。(2)与proBDNF对C6细胞的生物学作用相反,重组matureBDNF蛋白抑制C6细胞凋亡,促进C6细胞增殖、迁移和侵袭；而matureBDNF抗体促进C6细胞凋亡,抑制C6细胞增殖、迁移和侵袭,其效应呈剂量依赖性。结论ProBDNF和matureBDNF同时存在于胶质瘤细胞中。体内和体外实验结果提示,proBDNF作为一个功能性蛋白对胶质瘤的生长可能起到抑制作用,而natureBDNF是促进胶质瘤生长的主要形式的BDNF。ProBDNF/p75/sortilin通路可能起到平衡matureBDNF/TrkB通路的作用,proBDNF和matureBDNF的相对表达水平可能影响这两条通路对胶质瘤生长和恶性转化作用,可能提供对胶质瘤治疗的一个新的靶点。
【作者】熊静；
【导师】肖志成；周新富；
【作者基本信息】昆明医科大学，外科学，2013，博士
【关键词】脑源性神经营养因子；proBDNF；p75NTR；sonilin；神经胶质瘤；人；

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