酶催化表面仿生“糖被”的构建及其应用基础研究

【摘要】细胞膜表面的“糖被”在生命活动中具有十分重要的特殊功能,它们作为分子识别位点参与了众多生理和病理过程,如受精、发育、分化、病毒侵袭、癌细胞迁移、细菌感染等。为了进一步认识“糖被”的生物学功能,构建表面仿生“糖被”的基础研究备受关注。目前已报道的仿生“糖被”构建方法主要有两类：非共价固定和共价固定,前者存在糖缀合物合成困难、糖基化层不稳定等问题；后者在糖烯单体及活性糖苷合成／提纯困难、化学催化糖苷键形成反应无位点／立构选择性、需要使用有机溶剂等方面尚需改进。受生物体内糖基化过程的启发,研究者们探讨了酶催化糖基化法。这是一种绿色的方法,可在水相进行,其糖基底物无需前处理,糖苷键的形成反应具有高位点／立构选择性；更为重要的是,某些酶具有特殊催化机理,可一步催化得到复杂结构的聚糖,这为深入阐明糖生物学功能提供了重要的技术途径。本文旨在进一步研究糖苷酶、糖基转移酶催化法在表面仿生“糖被”构建领域的前景,以探讨该方法用于糖基化亲和膜制备可能性。具体研究工作从以下几个方面开展：通过表面等离子体共振仪(SPR)研究糖苷酶与常见糖基受体-多羟基聚合物刷的相互作用,发现聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)能特异性吸附糖苷酶(来源于苦杏仁的p-葡萄糖苷酶(Glu,EC3.2.1.21)和来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶(Gal,EC3.2.1.23)),并对酶活性造成抑制；而聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯(POEGMA)与糖苷酶的相互作用较弱且不会对酶活性造成抑制,因此是糖苷酶表面催化用较优糖基受体。通过石英晶体微天平(QCM)成功在线实时监测了Gal在糖基受体-聚乙二醇(PEG)单分子层表面的催化糖基化动力学过程,包括Gal与糖基受体的识别结合、糖基供体加入后引发的酶催化转糖基化,以及Gal从新生的糖基化表面的解离。测得的表面酶催化动力学常数(米氏常数(km)和催化速率常数(kcat))表明Gal能使PEG末端转糖基化,但是水相进行的糖苷酶催化逆水解反应表现出反应动力学上的困难性,引入表面的半乳糖基量相对偏少。通过QCM分别研究了葡聚糖蔗糖酶(DSase,EC2.4.1.5)在小分子糖基受体-葡萄糖／麦芽糖单分子层表面的催化动力学,比较了相关动力学常数,选择麦芽糖作为DSase催化糖基化聚合用优先糖基受体。在此基础上,基于表面引发原子转移自由基聚合(SI-ATRP)和BF3EtO2催化糖苷键形成反应在QCM金芯片表面构建麦芽糖受体聚合物刷,进而利用DSase催化糖基化聚合成功构建支化葡聚糖刷。与麦芽糖受体聚合物刷相比,所构建的支化葡聚糖刷结构上具有更多非还原端糖残基,增强了与ConA的特异性相互作用,所以其对ConA具有更强的亲和吸附,且所吸附的ConA能通过小分子竞争性洗脱剂α-甲基甘露糖(MM)完全亲和脱吸附。最后,结合紫外光辐照引发接枝聚合和模型表面Gal、DSase催化仿生“糖被”的构建,实施了聚丙烯微孔膜的表面糖基化。糖基化膜不仅具有较高亲水性还被赋予了糖基特殊的生物学识别功能。蛋白质吸附研究表明,糖基化改性膜对凝集素蛋白具有较强的特异性吸附性能,有望作为亲和膜应用在此类蛋白质的亲和分离。
【作者】方艳；
【导师】徐志康；
【作者基本信息】浙江大学，高分子化学与物理，2014，博士
【关键词】糖苷酶；糖基转移酶；表面糖基化；聚丙烯微孔膜；凝集素亲和分离；

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