程序性死亡分子-1信号通路对糖尿病视网膜病变调控机制的研究

【摘要】研究背景糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是目前危害中老年人视力最主要的致盲眼病之一。DR的发生和发展与多种因素相关,如高血糖、氧化应激、糖基化终末产物、细胞凋亡、细胞因子等。近年来许多学者都明确提出免疫机制参与DR的发生发展,DR也是一种自身免疫性疾病。免疫学发病机制逐渐成为DR的研究热点,主要集中在四个方面：(1)自身抗原和免疫细胞的异常表达诱导DR的自身免疫反应[4-8]；(2)炎症细胞和前炎症因子参与DR的病理过程;(3)抗炎药物对DR具有明确的治疗作用；(4)免疫遗传因素影响DR的发生。综上所述,DR虽然以视网膜微血管病变为病理基础,但却是自身免疫应答、炎症性免疫反应、免疫遗传等在内的多因素多途径综合作用的结果。细胞凋亡和炎症反应是DR的重要病理变化。激活诱导的细胞凋亡参与了细胞免疫状态的维持。免疫反应早期淋巴细胞被激活,进而引起细胞因子和细胞表面分子的变化,产生炎症反应。辅助性T细胞(helpTcell,Th细胞)是体内一类重要的免疫调节细胞,Th细胞根据分泌细胞因子和功能不同可分为Th0、Th1、Th2、Th3、Th17亚群,其中Th1细胞主要分泌IFN-γ、Th2细胞主要分泌IL-4。Th细胞主要通过调节细胞因子表达量改变免疫状态。探讨DR患者激活诱导细胞凋亡和细胞因子的变化,可以更好的了解DR患者的免疫状态。共刺激信号已经成为免疫学研究的一个热点领域。程序性死亡分子1(programmeddeath-1,PD-1)及其配体(programmeddeath-ligands,PD-Ls)属于CD28/B7家族,PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞；配体PD-L1和PD-L2主要表达于抗原提呈细胞,且PD-L1的表达更易被激活诱导。PD-1通过与PD-L1、PD-L2的IgV样结构域结合,将信号传至其细胞质区尾部的免疫受体酪氨酸抑制基序,从而抑制T细胞的活化和细胞因子的分泌。PD-1及其配体属于抑制性共刺激分子,其在自身免疫性疾病、器官移植排斥反应、病原微生物感染、肿瘤免疫逃逸等方面都发挥着重要作用[22-24]。综上所述,免疫机制参与了DR的发生发展,PD-1/PD-Ls信号通路作为重要的免疫抑制通路,我们推测它可能对DR的发生发展具有调节作用。本课题以DR作为研究主体,以PD-1信号通路作为研究对象,以外周血作为研究靶点,从激活诱导的细胞凋亡和Thl/Th2类细胞因子出发,观察PD-1信号通路在糖尿病视网膜病变患者中的表达及功能特点,探讨PD-1/PD-Ls信号通路在DR发病机制中的作用,以期为DR的发病机制提供新的理论依据,为此类疾病的预防和和治疗提供新的思路和方法。第一部程序性死亡分子1及其配体在糖尿病视网膜病变患者外周血中的表达目的：探讨PD-1及其配体PD-L1和PD-L2在2型糖尿病视网膜病变患者外周血淋巴细胞中的表达和意义。方法：临床检查确诊为增殖性糖尿病视网膜病变患者(proliferativediabeticretinopathy,PDR)41例,非增殖性糖尿病视网膜病变患者(nonproliferativediabeticretinopathy,NPDR)28例,糖尿病无视网膜病变患者(diabetesmellitusandnodiabeticretinopathy,DM-NDR)27例,同期行体检的健康志愿者59例纳入研究。收集受检者晨起空腹EDTA静脉抗凝血2ml,采用实时定量聚合酶链式反应(Realtimepolymerasechainreaction,RT-PCR)检测PD-1、PD-L1、PD-L2mRNA的表达水平,分析各组间表达水平的差异。结果：RT-PCR检测结果显示,PDR患者外周血淋巴细胞PD-1、PD-L1mRNA相对表达量比DM-NDR组及对照组降低,差异有统计学意义(PD-1:P=0.004;PD-L1:P=0.001)。PD-L2mRNA在PDR患者中也有降低的趋势,但差异无统计学意义(P=0.267)。结论：PDR患者外周血淋巴细胞PD-1、PD-L1mRNA相对表达量降低,提示免疫应答可能参与PDR的发病机制。第二部分程序性死亡分子1通路对糖尿病视网膜病变激活诱导的细胞凋亡调控机制的研究目的：探讨PD-1/PD-Ls信号通路对2型糖尿病视网膜病变激活诱导的细胞凋亡(activation-inducedcelldeath,AICD)调控的机制。方法：临床检查确诊为PDR患者24例,DM-NDR患者15例,同期行体检的健康志愿者15例纳入研究。收集受检者晨起空腹肝素静脉抗凝血4ml,分离淋巴细胞,使用植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)40μg/ml刺激淋巴细胞48小时,采用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,观察细胞表面PD-1、PD-L1、PD-L2蛋白的表达,分析PD-1/PD-Ls信号通路对PDR患者AICD的调控。结果：流式细胞结果显示,PDR组的细胞凋亡率高于DM-NDR组和对照组,差异有统计学意义(P=0.037,0.000),DM-NDR组的细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.048)。PDR组的PD-1蛋白表达率和凋亡细胞表面的PD-1蛋白表达率均高于DM-NDR组和对照组,差异有统计学意义(P=0.042,0.000;P=0.024,0.000),DM-NDR组的PD-1蛋白表达率和凋亡细胞表面的PD-1蛋白表达率和对照组相比,也有显著增高(P=0.031:P=0.037).PDR组的PD-L1蛋白表达率和凋亡细胞表面的PD-L1蛋白表达率均低于DM.NDR组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.009；P=-0.000,0.005),而DM.NDR组的PD-L1蛋白表达率和凋亡细胞表面的PD-L1蛋白表达率却显著高于对照组(P=-0.035；P=0.003)。三组均无PD-L2蛋白的表达。结论：PDR患者存在激活诱导的细胞凋亡增高的现象。PD-1信号通路通过AICD介导增殖性糖尿病视网膜病变的发生发展。DM-NDR患者的PD-L1蛋白表达和PDR患者相比反而增高,提示PD-L1可能保护糖尿病患者免受眼部损害。第三部分程序性死亡分子1通路对Th1/Th2细胞因子调控机制的研究目的：观察2型糖尿病视网膜病变Th1/Th2类细胞因子的表达,研究PD-1信号通路对2型糖尿病视网膜病变Th1/Th2类细胞因子的调控,从细胞因子角度探讨DR的发病机制。方法：临床检查确诊为PDR患者、DM-NDR患者和同期行体检的健康志愿者各15例纳入研究。收集受检者晨起空腹肝素静脉抗凝血4ml,分离淋巴细胞,使用50ng/mlPMA,1μg/mlIonomycin刺激淋巴细胞4小时,1.7μg/mlMonensin固定胞内细胞因子。采用流式细胞技术检测IFN-γ和IL-4的表达；观察PDR患者Th1/Th2比值的变化；分析PDR患者PD-1和Th1/Th2类细胞因子的相关性。结果：流式细胞结果显示,PDR组的IFN-γ和IL-4表达均高于DM-NDR组和对照组,差异有统计学意义(IFN-γ:P=0.028,0.000;IL-4:P=0.012,0.032).与DM-NDR组及对照组相比,PDR组PD-1+IFN-γ+细胞率显著增高(P=0.011,0.001),同时,PD-1+IL-4+细胞也显著增高(P=0.040,0.003)。IFN-γ+细胞和IL-4+细胞的比值在PDR组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.047),但PD-1+IFN-γ+细胞和PD-1+IL-4+细胞的比值在各组间无差异(P=0.590)。结论：PDR患者表现出以Thl为主的炎症反应。PD-1与PDR的Th1/Th2类细胞因子变化具有相关性,但与Th1/Th2比值变化并无关联,提示PD-1并非通过Th1/Th2失衡调控PDR的发展。第四部分糖尿病视网膜病变危险因素的相关性分析目的：观察PDR患者血β2微球蛋白的表达,分析血β2微球蛋白和前观察指标的相关性,探讨PD-1信号通路、凋亡、Th1/Th2类细胞因子对糖尿病微血管病变的临床预测性。方法：使用放射免疫法检测血β2微球蛋白的表达,分析血胆微球蛋白的表达与前观察指标的相关性,前观察指标均为前部分实验中流式细胞仪检测部分的结果,包括：PD-1蛋白、PD-L1蛋白、IFN-γ、IL-4、凋亡细胞率、AnnexinV+PI-PD-1+细胞、AnnexinV+PI-PD-L1+细胞、PD-1+IFN-γ+细胞、PD-1+IL-4+细胞。结果：PDR患者的血p2微球蛋白表达量为(3.07±1.79)mg/l,高于DM-NDR组(2.11±0.71)mg/l和对照组(1.73+0.53)mg/l,差异有统计学意义(P=0.028,0.000)。PDR患者血p2微球蛋白和凋亡细胞率(r=0.484,P=0.017)、IFN-γ(r=0.523,P=0.045)呈正相关,和PD-1蛋白(r=-0.515,P=0.034)、PD-L1蛋白(r=-0.765,P=0.004)、IL-4(r=-0.573,P=0.026)、AnnexinV+PI-PD-1+细胞率(r=-0.625,P=0.010)呈负相关。结论：糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变同属于微血管病变,在临床上有密切关联。PD-1信号通路和Th1/Th2类细胞因子与糖尿病微血管病变的发展有一定的相关性,为临床预测及诊断治疗提供了理论依据。
【作者】方梦园；
【导师】郭海科；
【作者基本信息】南方医科大学，眼科学，2014，博士
【关键词】程序性死亡分子1；糖尿病视网膜病变；mRNA；实时定量聚合酶链式反应；激活诱导细胞凋亡；PHA；流式细胞仪；PMA；IFN-γ；IL-4；β2微球蛋白；

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