河套平原强还原高砷地下水系统微生物分子生态学研究

【摘要】原生高砷地下水是当今国际社会面临的最严重的环境问题之一。目前,全世界有超过1.4亿人受到高砷地下水的威胁,高砷地下水遍及孟加拉国、印度、越南、智利、阿根廷、日本、美国和中国等国家。在我国,高砷地下水主要集中在新疆、山西、内蒙古、贵州、台湾等地,受影响人口高达300万人。砷是一种严重的致癌物质,长期摄入高砷地下水会导致诸多慢性疾病和癌症,如皮肤色素沉着、角膜炎、心血管疾病,甚至皮肤癌、肝癌、肾癌等,影响十分恶劣。当今国际社会对原生高砷地下水的研究主要集中在砷的水文地球化学、矿物学、沉积环境方面。已有研究表明,地下水和沉积物环境中砷的迁移转化是一系列复杂的微生物参与和地球化学过程共同作用的结果。微生物所具有的氧化还原能力和对敏感元素的抗性,使它们成为地质环境中一种重要的媒介物,影响着元素的迁移转化富集过程。目前,关于砷的释放机制主要有三种：黄铁矿的氧化、铁的羟基氧化物的还原性溶解和铁锰氧化物的阳离子竞争性吸附,微生物可能参与所有这些过程。然而目前国内外对微生物参与下砷的迁移与转化机理方面的研究还处于初步阶段,对高砷含水层中哪些微生物发挥关键作用、不同环境介质中微生物作用有无不同等问题还尚不清楚。因此,对高砷含水层中的微生物群落结构和多样性以及功能微生物群落进行研究,对理解微生物对高砷地下水中砷迁移转化的机理具有重要意义。本研究以我国原生高砷地下水典型地区内蒙古河套平原杭锦后旗为研究区,将地球化学分析与先进的微生物分子生态学手段和方法相结合,通过研究高砷地下水和沉积物中的微生物多样性及其群落结构特征,分析强还原高砷地下水中的功能微生物群落,并与地球化学参数相结合,探讨微生物群落在高砷地下水迁移富集过程中的作用机理。研究的主要成果如下：1.河套平原杭锦后旗典型强还原条件下高砷地下水和沉积物的地球化学特征。以杭锦后旗作为典型研究区,通过大量野外调查和前期研究总结,有针对性的采集了典型高砷地下水样品21件和3个钻孔(包括2个高砷钻孔和1个低砷钻孔)的垂向沉积物样品32件,分析了高砷地下水样品中水化学环境与砷浓度之间的关系,刻画了沉积物样品中砷(形态)、铁、硫、TOC等的垂向分布特征。研究区多数高砷地下水的氧化还原电位为负值,pH为近中性或弱碱性。样品总砷和三价砷的浓度范围分别为65.6-1088.7μg/L和14.5-560.3μg/L,其中超过半数样品的三价砷浓度高于五价砷浓度。三价砷浓度和总砷浓度之间呈现出良好的线性相关关系。总铁浓度变化为107-2257μg/L。甲烷浓度随着总砷浓度的增加而升高,最高值可达568.20μg/L。所有样品的硝酸盐含量都非常低,而硫酸盐含量只在总砷含量非常低时显著增高。样品中的TOC浓度为1.9-11.9mg/L。TOC含量以及Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅲ)均与总砷浓度呈现出正相关关系,而硫酸根含量则与总砷浓度呈指数负相关。多数高砷地下水样品具有高浓度的三价砷、TOC、Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅲ)和低浓度的硫酸根、硝酸根。高砷沉积物样品中砷含量为33.6-77.6mg/kg,而对照低砷沉积物样品的砷含量仅为1.5-5.8mg/kg。所有样品中均没有检测到一甲基砷和二甲基砷。在高砷沉积物钻孔中,三价砷的含量随深度而增加,但是所有样品均以五价砷为主。高砷沉积物中亚铁和三价铁的含量分别为0.05-7.01g/kg和0.38-5.29g/kg,亚铁和总铁的比值随着深度的增加而增大。总铁与总砷呈现出相同的变化趋势,与已有的研究结果一致。TOC含量为0.002-1.854wt.%,与总砷含量呈正相关关系。高砷沉积物主要出现在粘土和亚粘土样品中,这些样品同时表现出高浓度的硫、铁和TOC含量。2.浅层强还原高砷地下水系统中的微生物群落多样性和群落结构的空间变化规律。在以上研究结果的基础上,选取典型强还原区高砷地下水和沉积物样品,采用PCR-DGGE指纹图谱和16SrRNA基因克隆文库、IlluminaMiseq测序等微生物分子生态学研究方法,并结合样品中砷、铁、硫等的分布特征,研究高砷地下水系统中的原位微生物群落在地下水和沉积物中的空间分布特征及多样性。沉积物样品的PCR-DGGE指纹图谱分析结果表明,高砷沉积物中微生物群落结构与低砷沉积物显著不同。在图谱中,与假单胞菌属和不动杆菌属有关的条带随着总砷浓度的降低而逐渐淡出,而与硫杆菌属相关的条带随着硫酸根浓度的增加而增强。对高砷沉积物钻孔样品中微生物群落的系统发育关系进行构建,高砷沉积物中主要包括四类微生物：α-,β-,γ-变形菌和厚壁菌门。其中一些DGGE条带序列与假单胞菌、短波单胞菌和八叠球菌等菌有关,已有研究证明这些细菌种群具有很强的砷抗性。另一些条带序列与假单胞菌和硫杆菌十分相似,这两种细菌与淡水或土壤系统中的硫氧化和反硝化作用紧密相关。低砷沉积物样品中的优势种群主要与寒冷环境如海洋沉积物和永冻土中的微生物相似。研究发现,低砷沉积物样品的微生物群落多样性高于高砷沉积物样品,这与对孟加拉国含水层的研究结果一致。高砷沉积物样品的16SrRNA基因克隆文库研究结果发现,河套平原高砷沉积物中以β-变形菌为主,这与之前对高砷河床沉积物开展的研究结果相似。其中,超过70%的克隆子与具有硫氧化和铁氧化功能的硫杆菌高度相似。此外,假单胞菌、短波单胞菌和嗜氢菌属也是高砷沉积物中的优势种群。本研究组在已有的研究中发现在采样点有大量含砷黄铁矿的存在,推测在微生物群落如硫杆菌的作用下,含砷黄铁矿的氧化可能导致砷、硫和铁的释放,五价砷酸盐在氧化性矿物表面富集。此后,被吸附的五价砷被还原为在矿物表面吸附性较差的三价砷进入地下水系统。这可能是沉积物中以As(V)为主而地下水中则以As(Ⅲ)为主的原因。三个典型水样的16SrRNA基因克隆文库的研究结果表明：高砷地下水样品中的细菌群落分为12类,包括α-、β-、δ-、ε-和γ-变形菌门、绿细菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、放线菌门以及异常球菌-栖热菌门。其中三价砷占总砷比例最大的样品呈现出最高的群落多样性。此外,在纲的分类水平上,该样品以α-变形菌纲和β-变形菌纲为主,不同于砷含量最低和砷含量最高的两个样品。但是在属的分类水平上,三个样品的优势种群均属于不动杆菌属和假单胞菌属。总体来说,高砷地下水中的优势细菌群落包括不动杆菌属,假单胞菌属,短波单胞菌属,嗜酸菌属和水杆菌属。同样地,对高砷地下水中古菌群落的分析结果显示,砷含量最低的样品古菌群落多样性最高,说明砷的毒性可能降低高砷地下水中古菌的多样性。高砷地下水中古菌群落包括奇古菌门、泉古菌门和广古菌门。其中,奇古菌门是一类新分类的古菌,包括所有已知的氨氧化古菌。研究中与奇古菌门相关的条带亮度随着样品硝酸根浓度的降低和砷浓度的增加而逐渐减弱。文库分析结果显示高砷地下水中古菌的优势群落为甲烷丝状菌(属于广古菌门),Nitrosophaera(属于奇古菌门)和热变形菌(属于泉古菌门)。热变形菌可以利用H2作为电子供体进行硫还原。这些结果揭示出高砷地下水中微生物作用下的氨氧化和硫氧化反应的存在。高砷地下水IlluminaMiSeq测序结果表明水化参数不同的样品的微生物群落也显著不同。多数地下水中的优势种群包括不动杆菌、Rheinheimera、假单胞菌、Methylotenera、水杆菌、噬氢菌、泉发菌和LCP-6等,与文库分析结果基本一致。但在文库分析时未发现Rheinheimera,Methyloteenera,泉发菌和LCP-6,表明文库分析和高通量测序之间可能存在一定的偏差。研究发现,造成高砷地下水和低砷地下水差异性的前十位微生物种群包括不动杆菌、假单胞菌、Alishewanella、嗜冷菌、Rheinheimera、水杆菌、丛毛单胞菌和披毛菌。统计学分析结果表明,砷含量不同的地下水样品,其他的水化参数也显著不同。此外,高砷地下水与低砷地下水中的微生物优势群落显著不同,除了砷浓度主要影响外,其他环境因子也可能导致群落构成的不同。通过对同一采样点的沉积物和地下水样品的微生物群落对比发现,高砷沉积物中的微生物群落与高砷地下水中的微生物群落显著不同。沉积物和地下水中砷形态的不同分配,以及不同的微生物群落构成,都表明微生物作用下的沉积物和地下水中砷的迁移转化机制可能不同。3.强还原高砷地下水中的功能微生物群落研究高砷地下水环境中功能群落的多样性和丰度,能更好地理解微生物生态和与高砷环境相关的微生物作用。前面的研究结果表明,河套平原高砷地下水处于强还原条件下,并伴有高浓度的砷、TOC和甲烷以及低浓度的硫酸盐和硝酸盐。因此,本论文通过对微生物功能基因的研究,对河套平原高砷地下水中的硫酸盐还原菌、产甲烷菌、砷氧化菌和砷还原菌的群落结构特征与丰富度进行了分析。通过对细菌砷氧化基因aioA的基因文库分析,发现河套地区高砷地下水中的砷氧化菌均属于变形菌门,包括α-、β和γ-变形菌。其中,β-变形菌纲的克隆子均属于伯克氏菌目,与Rhodoferaxferrireducens、纤毛菌属和嗜酸菌属的细菌高度相似。Rhodoferaxferrireducens是一类可以进行异化铁还原的厌氧菌。纤毛菌属和嗜酸菌属的细菌曾从砷污染的沉积物或者含砷尾矿点分离得到。属于γ-变形菌纲的克隆与假单胞菌属和不动杆菌属的细菌相似,这与高砷地下水中的微生物群落中大量存在假单胞菌和不动杆菌的结果一致。属于α-变形菌纲的克隆与根瘤菌目的细菌,包括自养黄杆菌、慢生根瘤菌、氨基杆菌、Boseasp和汉氏硝化菌等相似。前人研究表明这些种属的细菌大部分来自从砷污染的土壤。河套高砷地下水中砷氧化菌优势群落包括Rhodoferaxferrireducens、纤毛菌、嗜酸菌、假单胞菌和不动杆菌。高砷地下水中的砷还原群落主要分布在δ-变形菌、β-变形菌、产金菌门和厚壁菌门以及不可培养未鉴定的群落,其中不可培养未鉴定的种群占到约三分之一。优势群落包括地杆菌、脱硫芽孢弯菌、产金菌和Desulfurispirillum,这些菌落多是能进行异化砷酸盐还原或者硫氧化的细菌。而未培养的群落与在西孟加拉和美国北犹他州高砷沉积物或地下水中发现的不可培养异化砷还原菌相似度较高。河套平原高砷地下水中砷还原菌和砷氧化菌的同时存在,也说明了地下水系统中与微生物作用有关的砷迁移转化的复杂性。对18个高砷地下水样品中的产甲烷菌进行分析,结果表明mcrA基因的丰度为3.01×103到3.80×106拷贝/L,在甲烷含量高的样品中丰度更大。mcrA基因占总古菌的比例(相对丰度)为0.0-30.2%。研究发现,mcrA基因的相对丰度与样品的总砷以及亚铁含量呈正相关,这可能预示产甲烷菌在砷含量高的样品中更加丰富,并且与含砷矿物的溶解有关。此外,mcrA基因的相对丰度与样品的硫酸盐含量呈明显的负指数相关,这与已有研究结果中提出的高砷地下水中硫酸盐的消耗可以加速甲烷的积累一致。克隆文库结果显示,高砷地下水中的甲烷菌包括甲烷微菌纲、甲烷杆菌纲和不可培养群落,其中83%克隆子属于甲烷微菌纲,包括甲烷微菌目和甲烷八叠球菌目。这些种属的产甲烷菌多分离自泥炭沼泽、消化淤泥、永冻土和金属污染的沉积物。此外,研究中发现一些克隆序列与已知的mcrA基因序列相似度极低,表明高砷地下水中可能有新的产甲烷类群的存在。对21个高砷地下水中的硫酸盐还原菌功能基因dsrB进行分析,发现高砷地下水中细菌16S基因和dsrB基因的丰度分别为8.74×106-4.12×109拷贝/L和0-4.9×106拷贝几。其中有7个样品的dsrB相对丰度超过0.1%,最高为2.1%。dsrB基因丰度与地下水样品的总砷浓度呈正指数相关关系,可以推测硫酸盐还原与砷和铁的还原可能同时发生。DGGE指纹图谱分析结果显示,高砷地下水中的硫酸盐还原菌属于厚壁菌门和δ-变形菌,优势群落包括脱硫肠状菌、脱硫叶菌、脱硫叠球菌和Desulfobacca。之前已有研究在砷污染环境中发现脱硫肠状菌能够将砷作为电子受体进行代谢。
【作者】王艳红；
【导师】王焰新；李平；JanetJansson；
【作者基本信息】中国地质大学，环境科学与工程，2014，博士
【关键词】微生物分子生态学；河套平原；高砷地下水；沉积物；

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