靶向HIV-1 gp41的病毒进入抑制剂的筛选及gp41 Loop疏水中心的功能研究

【摘要】艾滋病,即获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染引起一种严重的传染性疾病,以全身免疫系统严重损害为特征。联合国艾滋病规划署报告显示,截至2012年底,全球有超过3530万名艾滋病带菌者,其中有260万人是在2009年才确诊染病,全球范围内每天新增6300名艾滋病感染者。截至2014年2月,我国共报告现存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人约44.8万例。艾滋病已在全球范围内迅速蔓延,现已成为当今世界最危险的流行病之一,严重威胁着人类的生命和健康。如果防治措施不力,将对我国的人口健康和经济社会发展产生巨大的影响。当前,抗病毒药物治疗依然是防治艾滋病的主要方法。目前上市的抗HIV药物主要包括：蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitors,PIs)、逆转录酶抑制剂,包括核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleotidereversetranscriptaseinhibitors,NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleotidereversetranscriptaseinhibitors,NNRTIs)、整合酶抑制剂(IntegraseInhibitors)、以及进入抑制剂(HIVentryinhibitors)。临床上主要采用联合用药的方式进行治疗,即俗称“鸡尾酒疗法”的高效抗逆转录病毒疗法——Highlyactiveanti-retroviraltherapy,HAART)。鸡尾酒疗法通常由两种逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂组成,其利用不同靶标、不同作用环节的抗HIV药物的协同作用,有效地抑制HIV在人体内的复制,大大降低了病毒的发病率和死亡率,延长了患者寿命。但现有的大多数蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂被发现无法完全清除体内的HIV病毒,并且长期用药还易导致药物的耐药性,毒副作用,病人的耐受性,还存在费用高昂等突出问题。面对艾滋病全球蔓延的形势以及现有药物的局限性,临床上迫切需要高效低毒,使用方便,价格便宜的新型抗HIV药物[1]。HIV病毒只有在进入宿主细胞内后才能进行复制,进而导致细胞病变,而逆转录酶及蛋白酶抑制剂都是在病毒进入细胞后才发挥作用。HIV进入抑制剂能够阻止病毒进入细胞,在病毒复制早期即发挥抗病毒作用,因而对耐受前两类抗HIV药物的病毒依然有效,并可组成更多的“鸡尾酒”方案,用于艾滋病的治疗。因此,开发新的阻止HIV病毒进入靶细胞的HIV进入抑制剂已经成为目前抗艾滋病药物研发的热点。HIV进入靶细胞的过程是由其包膜蛋白gp160所介导的,gp160由两个亚基gp120和gp41通过非共价键连接。在HIV进入过程中,首先是gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)先后结合,随后跨膜亚基gp41的构型发生改变,介导病毒包膜与靶细胞膜的融合,完成病毒进入宿主细胞的感染过程。由于gp41的序列在病毒包膜蛋白中较为保守,且是病毒特有的蛋白,以其作为研究HIV进入抑制剂的药物靶点具有较大的优势。目前,主要以gp41形成的核心六螺旋束结构作为药物靶点之一。HIVgp41膜外部分具有两个螺旋重复序列,分别称为NHR和CHR。三分子gp41上的NHR与CHR分别发生反向结合,形成稳定的六螺旋束(6-HelixBundle,6-HB)结构,将病毒包膜与靶细胞膜的距离拉近而发生融合,介导HIV进入靶细胞内。HIV进入抑制剂T-20即是衍生于gp41CHR的一段具有抑制HIV与靶细胞融合和抗HIV感染作用的多肽。如果小分子化合物能抑制HIVgp41六螺旋束的形成,也将具有抑制HIV进入靶细胞的作用。2004年,纽约血液中心姜世勃教授筛选到2个“药物样(drug-like)”化合物,NB-2和NB-64[2]。但是,NB-2和NB-64的有效浓度仅在μM级别,远远大于T-20的用量,但可将其作为HIV进入抑制剂的先导化合物(hit),有望研发出更具效能的新型药物。正是基于这一思路,本课题组与军事医学科学院药理毒理研究所谢蓝教授团队合作,采用假病毒体系、体外模拟六螺旋形成的ELISA等方法筛选来自NB-64结构改造后的一系列的小分子化合物,从中发现了两个具有高效抗HIV-1活性且靶向于gp41的化合物。进一步采用多种分子生物学、生物物理学等实验方法探讨了这两个化合物的抗病毒的活性、作用机制及作用靶点。为后续产物的结构优化,寻找更多更有效的HIV-1进入抑制剂奠定基础。目前,HIV-1gp41靶点的药物设计大多是基于NHR和CHR形成六螺旋束结构,而针对疏水性功能区域融合多肽(fusionpeptide,FP)和跨膜区域(transmembranedomain,TMD)也逐渐成为人们研究和开发的重点。但目前尚未发现针于上述位点的有效药物。那么,在gp41上,是否还有其他位点也能够成为抑制HIV进入的靶点呢?这使得我们首先要对gp41各部位的功能和作用有更详细和深入的了解。HIV-1gp41NHR和CHR之间的连结区域loop,是在gp41上被发现的第三个疏水性区域,其序列也较为保守,已被证明在gp41介导融合的过程中至关重要。Loop的中心疏水区域存在一对保守的二硫键,两个半胱氨酸之间601位的碱性赖氨酸为这一段序列中唯一的亲水性氨基酸,可推测其在loop形态和功能中的重要性。因此,我们合成了包含中心区域的27个氨基酸的loop区域多肽以及K601A,L602A突变的loop多肽,研究其突变后对loop结构和作用的影响。这些结果将帮助我们更好的理解gp41在病毒膜与细胞膜融合过程中的作用和机制,为寻找更多可能的药物作用靶点指明方向。本课题为开发新的HIV病毒进入抑制剂提供新的思路。第一部分靶向gp41的HIV-1进入抑制剂的研究目的：通过高通量筛选方法筛选出具有抑制HIV-1感染靶细胞作用的小分子化合物,研究该化合物抗HIV-1进入的活性,评价其体外细胞毒性,并深入探讨其作用机制及可能的作用靶点。方法：1.用pSFl62病毒包膜蛋白质粒与pNL4-3.Luc.RF核心质粒共转染构建HIV-1假病毒,筛选化合物抑制假病毒感染的活性；抑制gp41六螺旋束结构形成的酶联免疫测定法(ELISA)快速检测化合物是否能够阻止NHR和CHR的结合。共有11个待检测系列化合物,阳性对照药物为T20或NB-64,PBS为阴性对照。2.通过假病毒体系包装HIV-1SF162、HIV-1JR-FL、HIV-1HXB2和VSV-G假病毒,检测有抗病毒活性的化合物是否具有抗HIV-1进入靶细胞的作用。同时利用细胞-细胞融合方法初步确定化合物在病毒复制周期中的作用机制和药物靶点。实验时检测化合物在50μM、25μM、12.5μM、6.25μM和3.125μM五个梯度稀释浓度时的作用,阳性对照药物为T20,PBS为阴性对照。3.MTT法评价化合物在100μM和6.25μM五个梯度稀释浓度时在体外对HIV-1作用靶细胞的细胞毒性,阳性对照药物为T20,阴性对照为PBS。4.用酶联免疫测定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)、圆二色谱法(CircularDichroism,CD)检测化合物抑制HIVgp41六螺旋束结构形成的活性。建立在细胞水平上的ELISA法检测化合物抑制抗CXCR4单抗与表达CXCR4细胞结合的活性。其中,ELISA选用50μM、25μM、12.5μM6.25μM和3.125μM五个梯度稀释浓度,N-PAGE选用400μM、200μM、100μM、50pM和25μM五个梯度稀释浓度,CD法为20μM,cell-basedELISA为25μM。阳性对照药物为NB-64、ADS-J1或AMD3100,PBS为阴性对照5.利用点突变技术对可能的作用靶点W571、K574、Q577和R579在pJR-FL质粒上进行改造,包装基因突变的假病毒,探讨化合物在HIVgp41上的作用靶点。实验时检测化合物在50μM、25μM、12.5μM、6025μM和3.125μM五个梯度稀释浓度时的作用,阳性对照药物为T20,PBS为阴性对照。6.采用SigmaPlot作图。采用GraphPadPrism5.0软件包进行数据分析,数据结果以x±s表示,多组间均数比较采用Oneway-ANOVA,多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验；两组数据间均数比较采用两样本t检验,p<0.05具有统计学显著性差异；剂量依赖反应关系分析取X=Log(X)后,采用Nonlinearregression和Pearson分析,Linearregression计算回归方程。结果：1.从来源于先导化合物NB-64的系列小分子化合物中筛选出XLHX-124-50和XLHX-130-7,两者在25μM时能够抑制HIV-1SF162假病毒感染(F=37.90,P=0.0000),且能抑制N36和C34结合形成六螺旋束结构(F=302.8,P=0.0000)。2.XLHX-124-50和XLHX-130-7对HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2这三种假病毒株的抑制作用呈剂量依赖性(r=0.9855、P=0.0021,r=0.9933、P=0.0007,r=0.9483、P=0.0140和r=0.9253、P=0.0242,r=0.9483、P=0.0140,r=0.8930、P=0.0413)。XLHX-124-50抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分别为19.65±2.63μM,13.95±3.34μM,23.09±1.10μM;XLHX-130-7抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分别为13.13±4.55μM,13.82±3.06μM,24.96±0.60μM。两个化合物均对VSV-G假病毒无明显的抑制作用(P>0.05),但由于样本量较小,尚不能完全否认其作用。细胞-细胞融合结果显示XLHX-124-50和XLHX-130-7均能有效抑制MT-2和CHO-WT细胞的融合,其IC50分别为14.44±1.24μM和9.54±0.37gM,两个化合物对细胞融合的抑制作用与剂量呈显著正相关关系(r=0.9800、P=0.0034,r=0.9718、P=0.0057)。3.XLHX-124-50和XLHX-130-7对各靶细胞U87.CD4.CCR5,U87.CD4.CXCR4,MT-2以及实验用细胞CHO-WT的体外细胞毒性作用均较低,其CC50值大于其抑制HIV-1假病毒的IC50值。4.利用衍生于HIVgp41NHR和CHR区域的多肽N36和C34,可以在体外形成类似gp41NHR和CHR结合的六螺旋束结构。因此,抗HIVgp41核心六螺旋束结构的活性可以用抑制N36和C34的结合来测定。ELISA法显示,XLHX-124-50和XLHX-130-7均能够抑制gp41六螺旋束结构形成,其作用呈剂量依赖性(r=0.9593、P=0.0098,r=0.9542、P=0.0117),IC50分别是23.05±1.44μM和10.29±0.76μM。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳通过比较gp4l核心结构条带形成的强弱来判断化合物对N36和C34六螺旋束形成的影响,圆二色谱法直观显示了N36和C34形成的多肽二级结构,结果均证实XLHX-124-50和XLHX-130-7均能剂量依赖性地抑制gp41六螺旋束的形成。5.细胞水平上的ELISA检测显示XLHX-124-50和XLHX-130-7没有抑制抗CXCR4单抗与表达CXCR4细胞结合的活性,其作用后的OD450值与PBS组比没有显著性差异(P>0.05),但样本量较小,所以尚不能完全排除化合物在高浓度时抑制单抗与细胞结合的作用。6.XLHX-124-50和XLHX-130-7均能剂量依赖性的作用于W571A、Q577A及R579A突变型HIV-1JR-FL假病毒(r=0.9267、P=0.0235,r=0.9204、P=0.0266,r=0.9399、P=0.0175和r=0.8997、P=0.0375,r=0.9035、P=0.0355,r=0.9648、P=0.0079),且抑制水平与野生型假病毒接近。但两个化合物都不能够抑制K574D突变的假病毒对靶细胞的感染。结论：筛选自一系列来源于先导化合物NB-64的小分子化合物发现,XLHX-124-50和XLHX-130-7具有抗HIV-1进入的活性,其作用靶点可能是HIV-1gp41NHR口袋区574位的赖氨酸残基。但是对于抗HIV-1的候选药物来说,其有效浓度依然在μM水平,且毒性CC50与抑制作用的IC50相差不显著,两个化合物可做为HIV-1进入抑制剂的先导化合物进行后续研究。第二部分HIV-1gp41Loop疏水中心的功能研究目的：合成突变了氨基酸位点的HIV-1gp41loop多肽(27aa),利用分子生物学、生物化学及生物物理学等多种实验方法研究其二硫键疏水中心疏水性的变化对loop区域在包膜内外功能和结构所产生的影响。方法：1.采用Fmoc固相合成法,合成多肽：L27WT为野生型的含有loop中心区域的27个氨基酸的loop多肽,L27K601A为突变601位赖氨酸为丙氨酸的loop多肽,L27L602A为突变602位亮氨酸为丙氨酸的loop多肽。2.通过所有的通用蛋白质资源库(universalproteinresource,UniProt)建立HIV和SIV包膜上的跨膜蛋白的数据资料,运用生物信息学方法,分析loop多肽的序列及疏水性,以及突变后多肽疏水性的改变。3.用RP-HPLC法直接测定loop多肽L27中心区域半胱氨酸的氧化动力学。含巯基的化合物可以与DTNB发生反应,利用DTNB直接显色法可以检测多肽在溶液中所含游离巯基的浓度,通过比较氧化前后的数据,计算出L27中半胱氨酸在溶液或脂质体溶液内是否形成二硫键及其程度。4.用ELISA的方法,检测了三种抗loop的单克隆抗体T32、240-D、246-D与各多肽之间的结合能力。比较突变后的多肽是否使loop的蛋白结构发生了改变,从而影响其固有的抗原表位,进而减少蛋白与抗体的结合。5.通过圆二色谱法(CircularDichroism,CD)检测loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A在水溶液和L-a-溶血磷脂酰胆碱(LPC)溶液中二级蛋白结构的变化。6.Loop序列中含有色氨酸(Trp,W)残基,通过荧光偏振的方法检测色氨酸在脂质体(PC:Chol为9：1)中的含量,分析和定量loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A与膜的结合,分析计算得到多肽与脂质体模拟的两性离子膜的结合能力。7.细胞膜和病毒的包膜皆为磷脂双分子层,膜的融合包括了内外膜的融合。通过荧光探针稀释实验来检测两性离子的脂质体融合,研究突变的多肽对于膜与膜融合的影响。8.采用SigmaPlot作图。采用GraphPadPrism5.0软件包进行数据分析,数据结果以x±s表示,多组间均数比较采用Oneway-ANOVA,多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验；两组数据间均数比较采用两样本t检验,p<0.05具有统计学显著性差异。结果：1.多肽的生物学分析显示,loop中心区域的两个半胱氨酸在序列中非常保守,而另一个碱性残基(赖氨酸K或精氨酸R)也在loop中心内相对保守,K601和L602突变后,多肽的疏水性发生了改变。RP-HPLC的结果也验证了该结果。2.DTNB直接显色法显示,LoopWT可以在水溶液状态下发生氧化,L602A不会减少loop多肽形成二硫键的能力,而K601A发生氧化反应的能力显著下降(t=6.917,P=0.0023),尤其当loop多肽处于膜状态下时(t=4.694,P=0.0094)。RP-HPLC与DTNB检测法的结果相似,L27K601A明显降低了疏水性增加的速度,即减少了loop多肽形成二硫键的能力。3.L27WT对抗loop抗体T32、246-D和240-D的亲和常数分别为4.4×10±106±1.5x106M-1,4.3×107±0.8×107M-1,1.9×107±0.4×107M-1。L27K601A和L27L602A均不能与T32结合,两者与240-D的亲和常数分别是8.6×106±1.4×106M-1和8.4×106±1.9×106M-1,L27L602A与236-D的亲和常数为6.1×107±0.2×107,而L27K601A却不能与246-D结合。4.在HEPES水溶液中,L27WT和L27L602A均呈现一种无规则的弯曲结构,而L27K601A有少量的α-螺旋结构。在膜模拟的环境中(1%LPC),L27WT有非常明显的α-螺旋,L27K601A和L27L602A与其有少量的α-螺旋含量差异。5.通过荧光偏振的方法检测色氨酸在脂质体中的含量,检测到L27WT,L27K601A和L27L602A与膜的结合常数分别为3.8×103±0.5×103M-1,7.2×103±1.8×103M-1,1.5×103±0.9×103M-1。6.荧光探针稀释实验检测两性离子膜与膜融合的结果显示,与L27WT相比,L27K601A可以增加膜的融合(t=5.439,P=0.0055),L27L602A却明显减弱了融合能力(t=15.42,P=0.0001)=L27K601A促进的几乎都是膜的全融合,其内膜的融合比L27WT增加了40%,而L27L602A则大部分为外膜的融合。结论：HIV-1gp41loop疏水中心区域二硫键之间的601位为亲水性的碱性残基赖氨酸,其并非是膜外部分决定loop结构和功能的唯一因素,但是能够平衡loop区域的的疏水性和极性,从而帮助gp41loop在融合进入过程的每一步骤中保持正确的结构,同时在膜的外侧发生氧化反应,并且引导膜上脂质体的结合。
【作者】裘佳寅；
【导师】刘叔文；YechielShai；
【作者基本信息】南方医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】艾滋病；人类免疫缺陷病毒；gp41；进入抑制剂；膜-膜融合；病毒融合蛋白；

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