热休克干细胞在心肌梗死治疗中的作用及其调控机制研究

【摘要】心肌梗死已成为全球的首位死因。目前标准疗法,包括药物治疗(溶栓)、介入治疗(支架植入)和外科手术(冠状动脉搭桥)虽然能改善患者症状甚至实现冠状动脉的血运重建,但是不能使己经死去的心肌细胞得以再生。2001年,Anversa课题组首先报道骨髓干细胞可以再生心肌后随即掀起干细胞向心肌细胞转分化研究的浪潮。经过十余年的研究探索,多种干细胞(包括胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ESC)/诱导多能干细胞(InducedPluripotentStemCells,iPSCs)、心脏祖细胞(CardiacProgenitorCells)/心脏干细胞/(CardiacStemCells,CSCs)、造血干细胞(HematopoieticStemCells,HSCs)等已经被证明具有向心肌细胞/内皮细胞分化的潜能。这些发现为未来干细胞移植在临床上治疗心肌梗死提供重要的证据支持。此外,近年来,各种重编程技术的发明使干细胞的体外分化效率不断提高。然而,当人们以为干细胞治疗心肌梗死的时代已经来临的时候,各项Ⅰ期临床试验的结果却显示患者短期的射血分数获益只有10%。那么原因是什么?现在公认的一个重要原因是干细胞在梗死心肌中(缺血缺氧微环境下)难以生存。据报道,干细胞移植到梗死心脏的一天存活率只有1%。显然,在低存活率的情况下,干细胞的功能不能得以充分发挥。因此,提高干细胞在梗死心肌的存活率成为国际上转化医学的重要课题。过去,曾报道用病毒携带抗凋亡基因来提高干细胞的存活率,然而病毒的潜在致癌风险和免疫排斥问题让这一办法难以在临床上广泛使用。那么,有没有办法既能有效提高干细胞的存活率又能避免使用病毒载体?本人在硕士阶段进行的课题研究中使用骨髓来源的Sca-1+细胞作为研究对象,发现与非Sca-1+细胞(non-heatshockedSca-1+cells,non-HSSca-1+cells)相比,热休克Sca-1+细胞(heatshockedSca-1+cells,HSSca-1+cells)(42℃,3h后行37℃孵育14小时)在体外糖氧剥夺模型(OGD8h)的存活率显著提高(LDHrelease:20.0%±2.7vs.42.5%±4.5%,p<0.01;TUNEL:15.2%±2.3%vs.38.6%±1.8%,p<0.01;AnnexinV-PEFlowCytometry:21.5%±1.6vs.39.5%±2.1%,p<0.01)。进一步分析发现热休克蛋白70(HeatShockProtein70,HSP70)在HSSca-1+细胞的表达显著上调(HSP20、HSP27、HSP90没有显著变化),而敲除HSP70后,热休克Sca-1+细胞的存活率显著减少,说明HSP70是其中关键的介导热休克Sca-1+细胞存活的分子伴侣蛋白。那么,调控HSP70表达的机制是什么?热休克干细胞在梗死心肌存活率如何?移植热休克干细胞能否使心梗小鼠的心功能及心肌纤维化得以改善以及其机制是什么?带着这些问题,本人开展博士阶段的课题研究。研究方法1.利用生物信息学软件预测靶向HSP70的microRNAs,并在HSSca-1+cells和non-HSSca-1+细胞进行microarray检测,找出其中具有统计学差异的microRNAs,然后对其进行靶标确认工作,包括gain-of-function、loss-of-function和报告基因实验；2.通过亚硫酸盐测序、生物信息学分析、染色质免疫共沉淀及启动子报告基因实验,寻找调控该microRNA表达的关键因素；3.对注射DMEM.雄性HSSca-1+和on-HSSca-1+细胞的心梗小鼠进行动态的超声心动图检测(移植后1周、2周、3周、4周),以评价心功能变化(EF、FS、LVDd,LVDs)。并通过Masson’sTrichrome染色观察移植后心肌纤维化的改变；4.将DMEM、雄性HSSca-1+和non-HSSca-1+细胞分别注射到雌性小鼠心梗区域,检测细胞在梗死心肌中的存活情况及对心肌细胞凋亡的影响；通过Westernblot、real-timePCR、染色质免疫共沉淀实验等检测影响心肌细胞存活的重要信号通路；分别从HSSca-1+和non-HSSca-1+细胞上清中提取外泌体(exosomes),并通过电镜、bioanalyzer、Westernblot对exosomes进行鉴定,研究exosomes对缺血心肌存活的影响,并挖掘促存活的重要信号通路。实验结果1.miR-34a靶向HSP70构成热休克干细胞的负性调节通路既往经典的研究报道热休克因子1(HeatShockFactor1,HSF1)结合到HSP70启动子HSF1反应元件(HSF1responsiveelement,HSF1-RE)上,激活HSP70转录是导致HSP70上调的重要原因。那么,除此之外,HSP70是否存在负调控机制?我们通过生物信息学软件预测了一系列可能靶向HSP70的3’UTR的microRNAs并在HSSca-1+细胞和non-HSSca-1+细胞检测了这些microRNA的表达,发现只有：miR-34a的变化具有统计学差异,且其表达下调约70%。于是我们马上对其进行靶标确认工作,包括：gain-of-function、loss-of-function以及报告基因实验来确认miR-34a是否靶向HSP70。首先,我们进行gain-of-function实验。我们将miR-34amimic(模拟物)和negativecontrol：阴性对照)到HSSca-1+细胞,并进行Westernblot实验,检测HSP70蛋白表达。结果发现,与转染negativecontrol的HSSca-1+细胞和不转染(native)HSSca-1+细胞相比,转染miR-34amimic的HSSca-1+细胞其HSP70的表达显著下调。另外,我们对上述各组细胞进行OGD处理并采用TUNEL方法检测凋亡率,发现转染miR-34amimic的HSSca-1+细胞其凋亡率显著增加(与negativecontrol-HSSca-1+细胞和nativeHSSca-1+细胞相比)。其后,我们进行loss-of-function实验。我们将miR-34a锁核苷酸抑制剂(LNAinhibitor)和negativecontrol(阴性对照)到Sca-1+细胞,并进行Westernblot实验,检测HSP70蛋白表达。结果发现,与转染negativecontrol的Sca-1+细胞和native(不转染)Sca-1+细胞相比,转染miR-34aLNAinhibitor的Sca-1+细胞其HSP70的表达显著上调。另外,我们对上述各组细胞进行OGD处理并用TUNEL检测凋亡率,发现转染miR-34aLNAinhibitor的Sca-1+细胞其凋亡率显著增加(与negativecontrol-Sca-1+细胞和nativeSca-1+细胞相比)。生物信息学分析、gain-of-function和loss-of-function实验支持了miR-34a靶向HSP70的假设。于是我们构建HSP703’UTR荧光素酶报告基因载体进一步确认miR-34a是否通过结合HSP703’UTR实现对HSP70的靶向抑制。我们发现与转染negativecontrol相比,转染miR-34amimic能显著抑制荧光素酶的表达(-70%),说明miR-34a对HSP70的3’UTR有较强的结合作用,能抑制萤火虫荧光素酶的表达。因而通过上述实验,我们确认miR-34a是靶向HSP70的microRNA。2.HSF1结合miR-34a启动子区导致染色质重塑是逆转miR-34a负性调节的关键因素上述我们已经确认miR-34a在HSSca-1+中显著下调。那么miR-34a下调的原因是什么?过去的文献报道启动子区发生DNA高甲基化是miR-34a下调的主要原因。然而,我们用经典的亚硫酸盐测序方法检测HSSca-1+细胞和non-HSSca-1+细胞启动子区DNA甲基化状态,发现两者甲基化状态并没有显著差异,说明启动子区高甲基化并不参与miR-34a的下调。然而我们通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现,与non-HSSca-1+细胞相比,HSSca-1+细胞中染色质开放的一个重要标记-组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)在miR-34a启动子区的富集显著减少,染色质关闭的一个重要标记组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)在niR-34a启动子区的富集显著增多,启动miR-34a转录的RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)在miR-34a启动子区的富集显著减少。这揭示了染色质开放和关闭状态的改变导致miR-34a的转录阻遏(repression)是miR-34a下调的直接因素。而过去的研究已经明确转录因子结合到启动子区是促发染色质开放和关闭状态改变进而导致转录阻遏的先导因素。那么在HSSca-1+细胞中,miR-34a启动子区是否结合了某个转录因子从而发生转录阻遏?我们通过生物信息学分析发现了miR-34a启动子区存在一个保守的HSF1-RE,我们进一步通过Westernblot发现HSSca-1+的细胞核内富集了大量的HSF1。之后,我们将野生型(WT)miR-34a启动子和剔除HSF1-RE(HSF1-REdeleted)的miR-34a启动子克隆到PGL4质粒并分别转染到HSSca-1+细胞及进行荧光素酶检测,发现与野生型miR-34a相比,克隆了剔除HSF1-RE的miR-34a启动子报告质粒其荧光素酶数值显著上调,提示miR-34a启动子区的HSF1-RE对miR-34a转录有阻遏作用。其后我们用特异性HSF1siRNA敲除HSSca-1+细胞中的HSF1,发现miR-34a的表达显著上调,HSP70表达显著下调,而当同时加入miR-34ainhibitor后,HSP70的表达能得以部分恢复,说明HSF1介导的miR-34a转录阻遏参与了HSP70的表达调控。最后,我们进一步用ChIP实验证实在我们预测的miR-34a启动子区HSF1-RE位点上有HSF1结合,并发现在该位点上,HSSca-1+细胞比’on-HSSca-1+细胞富集更多的HSF1。通过这些实验,我们确认HSF1在miR-34a启动子区的结合导致染色质重塑、转录阻遏是HsSca-1+细胞中miR-34a下调的关键因素。3.HSSca-1+细胞移植能显著减少缺血心肌的细胞凋亡、抑制心肌纤维化,并改善心功能我们发现,与non-HSSca-1+细胞相比,移植到梗死心脏的HsSca-1+细胞其存活率显著提高。其后,我们对进行注射DMEM.non-HSSca-1+细胞和HsSca-1+细胞的心梗小鼠通过超声心动图追踪其心功能的变化,发现与DMEM和non-HSSca-1+细胞相比,移植了HSSca-1+细胞的心梗小鼠,其射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)显著提高、舒张末期内径(LVDd).左心室收缩末期内径(LVDs)显著减少,说明移植HSSca-1+细胞能显著改善心梗后的心功能。此外,通过Masson’sTrichrome染色发现与DMEM和non-HSSca-1+细胞相比,移植了HSSca-1+细胞的心梗小鼠其心脏纤维化明显减少。那么心肌纤维化明显减少的机理是什么?我们通过TUNEL检测发现与DMEM和non-HSSca-1+细胞相比,移植HSSca-1+细胞能显著减少心梗后的心肌凋亡发生。进一步的检测则发现,移植HSSca-1+细胞的梗死心脏其HSF1和HSP70的表达显著上调,miR-34a表达显著下调,miR-34a启动子区的H3K4me3及PolⅡ富集显著减少、H3K27me3富集显著增高。移植了HSSca-1+细胞的梗死心脏和HSSca-1+细胞在HSF1、HSP70、miR-34a表达及miR-34a染色质状态的相似性让我们猜想HSSca-1+细胞是否通过旁分泌途径将促存活信号传递给缺血的心肌细胞?近年的研究发现exosomes是介导旁分泌效应的重要载体。于是我们分离non-HSSca-1+细胞和HSSca-1+细胞分泌的exosomes并进行鉴定,发现与non-HSSca-1+细胞分泌的exosomes相比,HSSca-1+细胞分泌的exosomes显著了大量的HSF1。进一步通过OGD及TUNEL实验发现,与HSSca-1+细胞分泌的exosomes孵育的心肌细胞,其抗凋亡能力显著高于与non-HSSca-1+分泌的exosomes孵育的心肌细胞,并且发现与HSSca-1+细胞分泌的exosomes孵育的心肌细胞其HSF1、HSP70的表达显著提高、miR-34a表达显著下调。miR-34a启动子区的H3K4me3及PolⅡ富集显著减少、H3K27me3富集显著增高。研究结论1.热休克预处理能显著促进Sca-1+干细胞在梗死心脏的存活,是改善干细胞体内存活率的行之有效方法。2.热休克保护作用主要由热休克蛋白HSP70介导。而在正常情况下,干细胞内miR-34a靶向HSP70,成为热休克保护的天然负性调节通路；热休克预处理能使miR-34a在HSSca-1+细胞中显著下调。3.miR-34a的下调不依赖常见的启动子区甲基化,而是由于热休克转录因子1(HSF1)结合在miR-34a启动子区的HSF1-RE,导致染色质重构,miR-34a转录阻遏并失去负性调节作用。4.HSSca-1+细胞移植能显著改善心梗后的心功能并减少纤维化,其机制可能是由于HSSca-1+细胞分泌HSF1富集的exosomes传递到缺血的心肌,诱导心肌细胞miR-34a区染色质重构,转录下调；解除miR-34a抑制后,HSP70上调从而使心肌细胞的凋亡减少。热休克促进干细胞生存、保护心肌细胞凋亡作用机制的阐明将为心肌梗死的防治提供崭新的研究思路和潜在的治疗靶点。
【作者】冯宇亮；
【导师】余细勇；
【作者基本信息】南方医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】Sca-1~+；干细胞移植；低氧；心脏；miR-34a；分子伴侣；组蛋白修饰；Exosome；

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