25D3和1,25D3介导胸腺基质淋巴细胞生成素在人支气管上皮细胞中的表达

25D3和1,25D3介导胸腺基质淋巴细胞生成素在人支气管上皮细胞中的表达

作者:师大云端图书馆 时间:2015-12-20 分类:参考文献 喜欢:3055
师大云端图书馆

【摘要】前言支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病,它和气道的炎性细胞和结构细胞以及细胞因子等有关。1990年,我国儿科哮喘协作组对27个省市0-14岁儿童进行调查,显示我国儿童哮喘的患病率为0.09%-2.60%,平均0.91%。2000年再次调查结果为0.12%~3.34%,平均1.54%,较10年前平均上升了64.84%。哮喘使很多患者日常生活受到不同程度的影响,据WHO估计,全球由于哮喘导致的调整伤残生命年数量估计达到1500万,约占全球总医疗负担的1%。由哮喘所带来的经济负担无论从住院和药品使用等直接医疗费用还是误工及非正常死亡等造成的间接非医疗费用都相当大。尽管多种新的治疗措施和方法已经在临床证实了确切的疗效,但是还有很多的问题需要解决。一方面很多的治疗并没有触及哮喘的根本,不能起到逆转治疗的效果。另一方面一些治疗手段还有不同的副作用,有的还需要不断地进行药物监测,给患者造成了极大的不便。因此,不断探索研究出更新的更有效的治疗手段是当前迫切的方向,其中从支气管哮喘病因这个源头去发现和探讨疾病的治疗方法或许是一个不错的选择。新的证据显示,维生素D不足可以引起包括哮喘在内的多种肺部疾病,这有可能是与肺功能受损而导致了感染和炎症的发生率增加有关。这种现象的内部机制尚不清楚,但是维生素D会影响炎症和结构细胞的功能,包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞和上皮细胞。羟化酶负责终止和限制25羟基维生素D3(25-hydroxyvitaminD3,25D3)以循环和储存的形式活化合成1,25二羟基维生素D3(l,25-hydroxyvitaminD3,1,25D3)。2008年,Hansdottir等报道了呼吸道上皮细胞表达1α-羟化酶,后者可以将维生素D活化,而维生素D本身会影响其驱使基因的表达水平,并在机体内发挥着重要的防御作用。1a-羟化酶在呼吸道上皮细胞中的表达表明维生素D在呼吸系统疾病中起着很普遍的影响。呼吸道上皮细胞不仅是物理屏障,也可以分泌细胞因子,例如发挥免疫应答作用的胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromallymphopoietin,TSLP)。TSLP是一种白介素-7(interleukin-7,IL-7)类似的新型细胞因子,TSLP作为肺内的一种多效性的细胞因子,在变应性炎症和哮喘中起着重要的作用。最近的研究已经着眼于TSLP产生机制,这有助于我们阐明TSLP如何支气管哮喘发生和发展中起作用的。现已证实,哮喘中存在TSLP基因在呼吸道上皮细胞中的过表达,TSLP在过敏反应免疫应答的发生和发展中起着重要的作用。在SCC25(humanoralsquamouscarcinomacell,SCC25,人上皮肿瘤细胞,由鳞状细胞癌衍生而来)中,TSLP的表达是由1,25D3诱导的。另有证据显示,局部应用1,25D3可以诱导小鼠表皮角质形成细胞中TSLP的表达使其增加。然而,维生素D是否会影响TSLP在人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelial,HBE)这一特定的细胞中表达尚不清楚。维生素D3上调蛋白(vitaminD3upregulatedprotein1,VDUP1)是硫氧还原蛋白的内源性抑制剂,它和维生素D发挥作用密切相关。VDUP1最初被认为是经由1,25D。处理过的白血病细胞(humanpromyelocyticleukemiacells,HL-60cells)的差异表达基因。该蛋白定位于胞质,在多种细胞反应中发挥着多种作用。最近的研究证实,VDUP1可以介导血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素1β信号转导通路。然而,VDUP1在支气管上皮细胞中的表达及其在这个细胞中的活化参与也鲜有人知。本研究旨在利用16-HBE细胞证实维生素D是否增强了TSLP在该细胞中的表达,以及在此过程中是否有VDUP1的参与,为探明支气管哮喘发生机制和治疗提供参考。材料和方法细胞培养和处理、转染16-HBE支气管上皮细胞在MEM培养基中培养,辅以10%胎牛血清,5%C02,37℃恒温潮湿培养箱培养。细胞培养至少两天(70%-80%融合),在刺激前分别用与不用25D3和1,25D3预处理6h后,给予1000nM伊曲康唑刺激2h。VDUP1靶向小干扰RNA(SiRNA)序列如下SiRNA1:上游5’-GUCAGAGGCAAUCAUAUUATT-3’,下游5’-UAAUAUGAUUGCCUCUGACTG-3’;SiRNA2:上游5’-CUGUGAAGGUGAUGAUAUUTT-31,下游5’-AAUCUCAUCACCUUCACAGTT-3’;SiRNA3:上游5’-GAAACAAAUAUGAGUACAATT-3’,下游5’-UUGUACUCAUAUUUGUUUCCA-3’;Negativecontrol(NO:上游5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,下游5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’=16-HBE细胞置于12孔培养板中培养两天,调整细胞浓度至每孔1.2×105个。待细胞融合40%-60%时,用5nMVDUP1特异性SiRNA和HiPerFect转染试剂对照SiRNA进行转染。以MTT法测定细胞活力。经转染的细胞另培养48h,用500nM的25D3和50nM的1,25D3分别刺激6h。使用1,25D3的酶联免疫测定试剂盒进行1,25D3定量RNA的分离提纯和RT-PCR以RT-PCR技术分析基因的表达和Mx3005p实时定量PCR(qPCR)系统进行分析。提取总RNA后,用RNAisoPLUS试剂盒。用PrimeScriptTM的RT试剂盒将RNA合成为500ngcDNA。该定量RT-PCR反映混合物中含有1*SYBR与ExTaq预混物、200nM正向和反向引物,并在25μL终体积中加入2μL的cDNA。使用的引物分别为:人TSLP(上游:5’-GCCCAGGCTATTCGGAAAC-3’,下游:5’-GAAGCGACGCCACAATCC-3’),VDUP1(上游:5’-ACTCGTGTCAAAGCCGTTAGGA-3’,下游5’-AGCTCAAAGCCGAACTTGTACTCA-31),β-actin(上游:5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游:5’-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3’)。通过CT(循环阈值:每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时,所经历的反应循环数)值来计算mRNA的相对表达水平。以β-actin为内参来进行RNA定量。WesternBlot分析细胞用PBS洗涤三次,在O℃裂解液中裂解。用Bradford蛋白测定法测蛋白质浓度。以10%SDS聚丙酰胺凝胶(每泳道40mg蛋白)电泳,转膜至PVDF膜。以5%脱脂奶的TBST液室温封闭1h,兔抗人VDUP1多克隆抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜(3×15min),1:5000辣根过氧化物酶孵育,室温抗兔IgG二抗孵育1h。SuperECL系统经由X线检测蛋白质信号。TSLP的酶联免疫吸附试验(ELISA)上清液中通过ELISA法检测(Bradford总蛋白标准化定量)测定TSLP。最低检测检测水平为31.25pg/mL统计方法数据采用(平均值±标准差)表示。组间差异用单因素方差分析法;以Bonferroni法进行多重比较。用单侧或双侧t检验单独比较两组间差异。P<0.05示有统计学差异。结果1、25D3诱导16-HBE细胞TSLP的表达不同浓度的25D3(50-1000nM)处理后,16-HBE细胞的细胞活力没有受到任何影响。根据剂量-效应曲线,TSLP的mRNA水平在25D3的100nM浓度时显著增加。并且随着25D3的浓度增力P,TSLP的nRNA水平不断增加,在500nM处达到峰值。因此,500nM浓度被选做后续实验。时间-反应结果表明(刺激条件:500nM25D3,持续2-24h)TSLP的mRNA表达和蛋白质的水平显著上调。2、25D3诱导16-HBE细胞VDUP1的表达25D3刺激0.5-24h后,细胞内VDUP1的mRNA和蛋白质的表达水平。结果表明,与对照组相比,500nM25D3刺激2-24h后,细胞内VDUP1的mRNA表达和蛋白质表达水平显著上调。3、下调VDUP1的蛋白表达针对VDUP1合成了三种siRNA(siRNA1和siRNA2,siRNA3)(详见材料与方法)。从转染的siRNA2或siRNA3的细胞裂解液中发现VDUP1水平降低。这种现象在siRNA3中更加明显,与对照组相比,VDUP1的表达减少了35%,VDUP1siRNA3被选做后续实验。4、VDUP1的沉默降低了在16-HBE细胞中25D3介导的TSLP的合成采用VDUP1siRNA来抑制16-HBE细胞中VDUP1的表达。用siRNA转染的细胞存活率大于90%。在同样浓度D3(500nM)刺激下,经siRNA处理后的VDUP1沉默的细胞,其TSLP的mRNA和蛋白表达水平都有显著降低。5、la-羟化酶抑制后限制了16-HBE细胞中25D3活化为1,25D3,并且减弱了TSLP的表达25D3存在时,16-HBE细胞可以不经任何刺激的情况下,将25D3活化为1,25D3。经1000nM伊曲康唑预处理的16-HBE细胞,25D3活化为1,25D3的能力显著降低。在1000nM伊曲康唑预处理后,由25D3介导的TSLP的mRNA和蛋白水平显著降低。6、VDUP1的沉默降低了16-HBE细胞中1,25D3介导的TSLP的表达水平不同浓度的1,25D3(0.1-100nM)中,16-HBE细胞活力没有变化。根据剂量-效应曲线,1,25D3在0.1nM处,TSLP的nRNA和蛋白水平显著增加,并在50nM处达到峰值。而当同样在50nM浓度的1,25D3时,TSLP的mRNA和蛋白质的表达水平在2h时显著增加,并在12h处达到峰值。50nM浓度的1,25D3刺激6h后,测得、/DUP1的mRNA的表达水平。结果表明,在16-HBE细胞中,与对照组相比,在50nM终浓度的1,25D3刺激6h后,VDUP1的mRNA的表达显著上调。与对照组siRNA处理过的细胞相比,经由50nM浓度的1,25D3处理后的细胞,当VDUP1基因沉默表达时,其TSLP的mRNA和蛋白水平显著降低。以上结果显示,在16-HBE细胞中,1,25D3是经由VDUP1通路介导TSLP的表达。7、1a-羟化酶的抑制对在16-HBE细胞中1,25D3诱导的TSLP表达水平没有明显的影响1000nM的伊曲康唑预处理16-HBE细胞,仍然会有1,25D3介导生成TSLP。这进一步支持了16-HBE细胞在维生素D活化并介导TSLP表达通路中,1α-羟化酶并未发挥作用。结论1、非活化的25D3和活化的1,25D3都可以介导16-HBE细胞中TSLP的表达;2、1α-羟化酶经伊曲康唑抑制后,部分抑制了25D3(而不是1,25D3)的TSLP在16-HBE细胞中的表达;3、与25D3相比,极低浓度的1,25D3更能显著增加TSLP在气道上皮细胞中的表达;4、维生素D对TSLP基因表达的影响是间接的。
【作者】彭成华;
【导师】邹飞;
【作者基本信息】南方医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2014,博士
【关键词】维生素D;维生素D上调蛋白1;胸腺基质淋巴细胞生成素;16-HBE细胞;

【参考文献】
[1]张健.EYS公司绩效管理系统设计[D].四川大学,工商管理,2003,硕士.
[2]张新政,刘洪伟,刘永清.多组滞后非线性控制大系统的结构与关联鲁棒镇定[J].控制与决策,1997,S1:496-499+527.
[3]高胡萍.剩余收益模型在房地产企业估值中的应用[D].华中科技大学,资产评估,2013,硕士.
[4]王利娟.我国上市公司自愿性信息披露水平影响因素实证研究[D].东北大学,会计学,2010,硕士.
[5]孙玉军.水利水电工程快速施工研究[D].天津大学,2003.
[6]温运城.银河巨型计算机工程团队师承研究[D].国防科学技术大学,科学技术哲学,2012,硕士.
[7]徐曼.基于高通量DNA芯片合成、测序技术的抗体亲和力成熟研究[D].中国科学技术大学,生物化学与分子生物学,2010,博士.
[8]李幸.3D深度图像的估计及编码[D].北京交通大学,2015.
[9]班玉霞.长程视频脑电图在发作性疾病诊断中的作用[D].延安大学,内科学,2014,硕士.
[10]本报记者曹继军 颜维琦本报通讯员朱璎.听“碳时代”的脚步声越来越近[N].光明日报,2011-08-02006.
[11]郑云肖.锑基(锡基)/碳纳米复合材料的制备及其电化学储锂性能研究[D].浙江大学,2013.
[12]邓琳君.贵州省湿地保护立法问题研究[D].贵州民族大学,经济法学,2012,硕士.
[13]汤广福,贺之渊,庞辉.柔性直流输电工程技术研究、应用及发展[J].电力系统自动化,2013,15:3-14.
[14]余忆玄.铜、铬对PFOS在沉积物上吸附行为的影响规律研究[D].大连海事大学,海洋化学,2013,硕士.
[15]王乐平.秦皇岛齐二数控机床有限责任公司营运资金管理研究[D].燕山大学,工商管理,2013,硕士.
[16]芦文波.校友资源开发视角下高校校友会组织研究[D].内蒙古农业大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[17]周志华.基于Web和中间组件的柔性客户关系管理系统设计[D].浙江大学,2003.
[18]张文学.应用合作学习法提高高中生英语写作能力的探究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[19]桑士宝.中空二氧化钛纳米球的制备及其光催化性能研究[D].黑龙江大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[20]沙聪雪.基于有限元的实时变形技术研究与应用[D].南京航空航天大学,航空宇航制造工程,2014,硕士.
[21]喻婧.基于RS和农用地分等的武穴市耕地生产能力核算研究[D].华中师范大学,土地资源管理,2014,硕士.
[22]黄惜惜.ZnO微/纳米分级结构的合成及荧光、酒敏性能研究[D].郑州大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[23]郭延祥.针对高分辨率背景复杂图像的车牌定位算法研究[D].浙江大学,电子信息技术及仪器,2014,硕士.
[24]何东宁.审前准备程序价值功能的实现[D].湘潭大学,法律,2003,硕士.
[25]朱洁.冻融循环作用下宽级配砾质土作为GCL保护层的抗剪强度试验研究[D].宁夏大学,水利工程(专业学位),2014,硕士.
[26]施洋.高校女大学生“成长”问题研究[D].东北石油大学,思想政治教育,2013,硕士.
[27]彭杰.融合·共生——现代高校校园入口空间解读[D].合肥工业大学,建筑设计及其理论,2004,硕士.
[28]周高超.高校艺术类大学生辅导员队伍存在问题与建设对策[D].西南大学,思想政治教育,2012,硕士.
[29]南菊红.基于分层分段数据模式的DLRF设计与研究[D].太原理工大学,2003.
[30]云志刚.中国体育彩票运营管理模式研究[D].内蒙古大学,公共管理,2013,硕士.
[31]墨宏山.2011年中国大陆科研机构在PlantCell上发表的研究论文[J].中国基础科学,2014,03:55-57.
[32]田雪.厄洛替尼与化疗药物不同次序给药对NSCLC细胞的作用[D].大连医科大学,肿瘤学,2012,硕士.
[33]查明威.表演教学法在尼泊尔中小学汉语课堂中的应用研究[D].渤海大学,汉语国际教育(专业学位),2014,硕士.
[34]张丽娜.山西省农村体育公共服务供给现状与对策研究[D].山西师范大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[35]杨晓晖.试论风景油画中的意象性语言倾向[D].云南艺术学院,当代架上绘画,2014,硕士.
[36]王藕眠.调查英国时装市场电子商务营销的成功因素[D].华中师范大学,工商管理(专业学位),2013,硕士.
[37]倪建龙.β3GnT8在结肠癌细胞株转移中的分子机制及转录因子c-jun对β3GnT8的调控作用[D].苏州大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[38]艾娟,张瑞雪,徐国祥,赵中琴,吴冰.电动汽车锂离子电池安全性能的专利分析研究[J].石油和化工设备,2013,09:46-50+60.
[39]马帅.燕赵非物质文化信息系统设计及景观分析[D].河北师范大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[40]尤焕杰.多模态原子力显微镜控制系统研制及实验[D].合肥工业大学,精密仪器及机械,2014,硕士.
[41]吴铮.基于特征的图像配准算法研究[D].浙江大学,2006.
[42]李连春,陆心丹,蔡连重.一重集团公司设计制造的国产六辊轧机[J].一重技术.1998(03)
[43]易丹.株洲县农村劳动力外流对农村经济的影响研究[D].中南林业科技大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[44]陈斐.磁性表面印迹复合光催化剂的制备及选择性降解抗生素的研究[D].长安大学,环境工程(专业学位),2013,硕士.
[45]张锡平.工业气相聚乙烯质量指标在线估计的研究与应用[D].北京化工大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[46]江丰元.结晶振动器偏心轴调心滚子轴承载荷及寿命分析[D].华东理工大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[47]唐倩.认知诗学视阈中意象的认知机制研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[48]胡捷.嵌入式驾驶员疲劳检测系统的研究[D].长安大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[49]叶文华.不同海情海面与目标复合电磁散射理论与实验研究[D].西安电子科技大学,无线电物理,2012,硕士.
[50]陈妍.基于时滞分解方法的线性时滞系统的稳定性分析[D].杭州电子科技大学,控制工程,2014,硕士.

相关推荐
更多