骨膜蛋白在正畸牙周膜改建中的表达及调控机制
【摘要】研究背景和目的：长期以来,正畸治疗错合畸形的一个突出问题就是临床治疗疗程长,也是众多牙颌畸形患者特别是成年患者决定是否矫治的关键因素之一。研究如何在对牙周组织、牙根和牙髓无可逆性损伤的条件下加快正畸牙齿移动,缩短正畸治疗疗程,成为本学科的研究热点和难点。现在人们的研究热点逐渐集中到机体对正畸力的生物学反应上。在正畸临床中发现没有牙周膜的粘连牙或者种植牙都不能发生移动,这就提示我们：如果只有力的作用,而没有牙周膜的改建,牙齿还不能移向所希望的位置或维持在必要的位置上,因此正畸牙齿移动有赖于牙周组织的相应反应,正畸牙齿的移动必须以牙周膜和牙槽骨的改建为前提。在正畸治疗过程中,机械力刺激通过牙齿传递到牙周膜,引发和激活其内部各种效应细胞的生物代谢活性,从而影响牙周组织的塑形和改建,最终使牙齿移动到位。也就是说牙周膜是正畸治疗的生理介质,它是一种变异的骨膜,具有明显的骨沉积和骨吸收能力；位于牙骨质与牙槽骨两种硬组织之间,由致密结缔组织所构成,多数纤维排列成束,其两端分别埋于牙骨质内牙槽窝的骨壁里,使牙齿固位于牙槽窝内。胶原纤维成束状排列,它可充分缓冲和吸收作用力,在牙周组织、牙周膜损伤修复中起着至关重要的作用。牙周膜在接受机械力刺激后,通过信号转导系统将力学刺激转化为生物学信号,引起牙周组织代谢的改变和牙槽骨改建等一系列生物学反应,这是一个十分复杂的过程,涉及到多种信号转导分子和通道以及各种基质蛋白、细胞因子。骨膜蛋白(Periostin,PN)是一种新发现的多功能细胞外基质蛋白,分子量为90kD,在骨膜和牙周韧带定位表达。骨膜蛋白可被转化生长因子β(TGFβ)诱导表达,其支持细胞粘附、胶原蛋白的交联和调节纤维形成,对牙周组织的完整性、牙齿发育、萌出以及机械应激导致的组织修复和再生发挥着重要的作用；被认为是对牙周膜稳态调节有关键作用的细胞外基质蛋白,其可能对牙周病及正畸牙移动中牙周组织改建也起着关键的作用。PN与TGF-β1的关系越来越受各界的关注,多项研究表明PN参与多个系统疾病的发生发展,且其表达与TGF-β1有密切关系。气道上皮细胞分泌PN可激活TGF-β1,进而促进气道纤维化并降低气道弹性导致哮喘发生；在心脏方面研究发现PN参与心肌胶原的合成和成熟,培养鼠胚胎时期的成纤维细胞,经TGF-β1刺激后,PN蛋白基因敲除后胶原的合成量仅为野生型的胚胎鼠胶原合成量的32%。由此可见PN蛋白是成纤维细胞合成分泌胶原的主要信号通道。Norris研究发现在PN基因敲除小鼠中心肌表现出较低的胶原蛋白变性温度,说明交联的胶原蛋白水平降低,PN可调节Ⅰ型胶原纤维形成,而且能够与Ⅰ型胶原直接相互作用,从而成为纤维结缔组织的生物力学特性的重要作用介质。Rios利用X线及Micro-ct观察敲除骨膜蛋白基因的小鼠牙齿牙周膜发育状况,牙齿发育萌出到建立正常咬合前,PN-null小鼠牙周膜于正常对照组相比无差别；牙齿萌出承受咀嚼力后3月龄实验组小鼠牙周组织出现明显破坏、牙周附着降低、牙槽骨吸收,表明在咬合力作用下骨膜蛋白在维持牙周膜的完整性和功能方面起着不可或缺的作用,在功能减退组的表达水平的改变可能会被认为是一种对环境变化的适应形式。Choi降低Wistar大鼠的右上第一磨牙咬合后的研究结果显示：最初牙周膜纤维数量减少、纤维变薄、随后牙周膜纤维和它们在牙槽骨的附着排列变得混乱,最终牙周膜纤维失去其网状结构。PNmRNA表达在24h大幅下调,这一变化持续在整个实验过程中。证实在缺乏机械应力的情况下,伴随着牙周膜中PN水平的减少,牙周膜纤维系统开始出现退化。Wen对TGF-β1和FAK调节PN在牙周成纤维细胞中的表达的作用进行了研究,用TGF-β1处理显著增加PNmRNA水平,粘着斑激酶(FocalAdhesionKinaseFAK)抑制剂有衰减作用。即使用循环应力刺激后,FAK敲除的成纤维细胞中也没有检测至PNmRNA的表达。这些结果提示,PN蛋白在人牙周膜中强烈表达,可能会涉及FAK依赖的通路的调节。最新研究证实炎症介质(TNF-α)和细菌毒素因子(LPS)能显著降低牙周膜成纤维细胞表达骨膜蛋白,表明PN在牙周病发生发展过程中是一个重要因子。这也提示我们在牙周患者进行正畸治疗时,口腔卫生的清洁护理、炎症的治疗控制是多么重要的前提；否则牙周组织遭到破坏、正畸牙周组织的改建、骨组织改建和正畸牙齿的移动根本无从谈起。PN作为一种重要的细胞外基质蛋白已引起广泛的关注,在全身多个系统都具有重要的作用,现对其研究也日渐深入。PN作为应力作用下维持牙周膜的完整性和功能方面起着必不可少作用的关键因子,对其体外方面研究多集中于牙周膜细胞加力机械刺激,涉及多因素体内研究却相对较少。通过建立小鼠正畸牙齿移动模型来研究PN在正畸牙齿移动过程中牙周组织改建作用还未见相关报道,PN在各疾病中特别是牙周组织的作用及其机制的研究尚不清楚。本研究将首次建立小鼠正畸牙齿移动模型,运用定量免疫组化、Micro-ct、QRT-PCR、Westernblot以及敲除PN基因小鼠等方法研究PN在牙周膜改建调控作用及相关信号通路。由于小鼠牙周膜过少,难以进行蛋白水平功能检测。本实验拟通过收集正畸临床患者拔除前磨牙牙周膜,采用QRT-PCR和蛋白组学技术进一步研究PN在正畸牙周组织改建作用的分子信号通路,深入探讨PN在正畸牙齿移动过程中牙周组织改建及其分子机制。为进一步系统性探讨机械力作用下牙周组织改建的分子生物学机制开辟了一条新途径,有助于更好的理解正畸牙齿移动的机理,从而为加快牙齿移动的正畸临床研究提供理论依据。方法：1.利用自制口腔微型装置建立小鼠正畸牙移动模型利用自制口腔微型装置和口腔显微镜在小鼠切牙和第一磨牙之间用NI-TI拉簧固定、加力20g,分别在加力1、3、5、7d后处死小鼠,固定、脱钙、制作小鼠第一磨牙牙周组织石蜡切片,观察HE染色牙周组织形态学和磨牙间变化。2.观察小鼠正畸牙齿移动中牙周膜PN表达的变化建立小鼠正畸牙移动模型,分别在加力1、3、5、7d后处死小鼠,制作免疫组化切片,用免疫组织化学和图像定量分析技术检测牙周膜PN表达的变化。3.PN基因敲除小鼠基因型的鉴定剪取基因敲除小鼠尾部0.5cm放入标记好的EP管内,提取DNA,根据设计引物进行PCR扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后取出置于紫外灯下观察并拍照。鉴定基因小鼠标准为：PN+/+基因型小鼠PCR扩增产物为691bp,PN-/-基因型小鼠是PCR扩产物为500bp。4.Micro-ct影像学检查处死C57BL和PN基因敲除小鼠,分离上下颌骨,分别选取各组小鼠上、下颌骨,标记好各组标本,固定于专用扫描管中,使用显微CT成像系统进行断层扫描成像,对牙周组织进行评估。5.RT-PCR检测小鼠牙移动牙周膜改建中与PN相关信号通路调控因子建立小鼠正畸牙移动模型,分为C57小鼠未加力组、C57小鼠加力组、PN-null小鼠未加力组、PN-null、鼠加力组,分别加力5d后处死,拔出牙齿放于盛有裂解液的EP管中,实时荧光定量PC检测牙周膜中PN、TGF-B1、FAK相关信号通路调控因子的表达,并统计分析各组之间PN、TGF-B1、FAK表达的相关性。6.RT-PC检测人正畸和未正畸牙周膜中与PN相关信号通路调控因子对照组为重度拥挤病例,实验组为牙列整齐、牙弓前突病例。对照组和实验组均为拔出前磨牙的青少年正畸患者,实时荧光定量PCR检测牙周膜中PN、TGF-B1、FAK相关信号通路调控因子的表达,并统计分析各组之间PN、TGF-B1、FAK表达的相关性。7Westernblot检测人正畸和未正畸牙周膜中与PN相关信号通路调控因子Westernblot检测人正畸和未正畸牙周膜中PN、TGF-B1、FAK、P-Akt、AKT相关信号通路调控因子的表达,并统计分析各组之间PN、TGF-B1、FAK、P-Akt、AKT表达的相关性。结果1.加力过程中牙齿按设定的方向移动,加力组第一磨牙与第二磨牙之间出现间隙。加力组张力侧牙周间隙变宽,牙周膜中纤维排列疏松,细胞成份增多,牙槽表面可见活跃的成骨细胞和新骨沉积,压力侧牙周间隙缩窄。2.PN在牙周膜呈阳性表达,着色相对较浅,分布较均匀。正畸加力组大鼠牙周膜中PN表达增强,牙周膜阳性染色强。与Od对照组比较,加力实验各组牙周膜PN表达均增强(P<0.05),与1d组比较,3d、5d组牙周膜PN表达均增强(P<0.05),7d加力实验组PN表达无统计学意义(P>0.05)。与3d加力组比较,5d、7d加力实验组(P>0.05)差异无统计学意义(P>0.05)；与5d加力实验组比较,7d加力实验组牙周膜PN表达显著减弱,(P<0.01)。5d组是小鼠整个牙齿移动改建周期中PN表达量最高。3.1泳道只有一个目的条带,亮度强,条带范围在691bp处,根据判定标准判定为WT小鼠。2泳道也只有一个目的条带,亮度较强,条带范围在500bp左右,因此根据判定标准判定为PN-/-小鼠。4.小鼠Micro-ct三维重建图显示：与对照组C57小鼠相比,PN-null、鼠牙周组织破坏,牙槽骨出现明显的水平吸收,磨牙根分叉区完全暴露。小鼠Micro-ct曲面断层图显示：与对照组C57小鼠相比,PN-nul1小鼠牙周组织破坏,牙槽骨出现明显的吸收,牙槽脊顶消失,牙周膜连续性中断破坏。5.与C57未加力对照组相比,C57小鼠牙加力实验组牙周膜中PNmRNA表达增强,(P<0.05)差值有统计学意义；FAKmRNA表达显著增强,(P<0.05)差值有统计学意义；TGF-B1mRNA表达显著增强(P<0.05)差值有统计学意义。与PN-null未加力对照组相比,PN-nul1加力实验组牙周膜中FAmRNA表达增强(P<0.05)差值有统计学意义,TGF-B1mRNA表达显著增强,(P<0.01)差值有统计学意义。与PN-null未加力对照组相比,C57未加力组牙周膜TGF-B1mRNA表达显著减少,(P<0.01)差值有统计学意义,FAKmRNA表达显著增强,(P<0.01)差值有统计学意义。与PN-nul1加力组相比,C57加力实验组牙周膜TGF-BmRNA表达减少,(P<0.05)差值有统计学意义；FAKmRNA表达显著增强,(P<0.01)差值有统计学意义。6.与人正畸未加力对照组相比,人正畸加力实验组牙周膜中PNmRNA表达显著增强,(P<0.01)差值有统计学意义；FAKmRNA表达显著增强,(P<0.01)差值有统计学意义；TGF-B1mRNA表达显著增强,(P<0.05)差值有统计学意义。7.与未正畸组相比,人正畸组牙周膜PN、TGF-B1、FAK、P-Akt的蛋白表达均显著增高,(P<0.01)差值均有统计学意义。与未正畸组相比,人正畸组牙周膜Ak、a-tublin的蛋白表达均没有明显差异,(P>0.05)差值无统计学意义结论1.首次成功建立了小鼠正畸加力模型,小鼠正畸牙齿移动过程中,牙周膜中PN表达增强且贯穿牙周膜改建的全过程,从而确定PN参与了小鼠牙齿移动中的牙周膜改建。2.PN是保持牙周膜的结构和功能完整性所必需的,是正畸作用下牙周膜的改建过程一个重要分子环节,发挥着转导调控作用。3.TGF-B1-PN-FAK信号通路参与调控了正畸作用下牙周膜的改建过程,FAK可能通过除TGF-B1-PN-FAK信号通路之外的其他途径参与了牙周膜改建的过程。4.TGF-B1-PN-FAK可能通过激活下游的Akt磷酸化信号通路,对正畸力牙周膜改建中进行调控。
【作者】徐会勇；
【导师】欧阳钧；吴补领；
【作者基本信息】南方医科大学，人体解剖与组织胚胎学，2014，博士
【关键词】骨膜蛋白；正畸；牙周膜；改建；
【参考文献】
[1]裴耀.分位数回归及其应用[D].华中师范大学,概率论与数理统计,2014,硕士.
[2]袁洲.北京市商品房销售价格的影响因素分析[D].清华大学,数学,2013,硕士.
[3]姜明.中国技术创新近百年历程及产官学一体化趋势研究[D].湖南大学,科学技术哲学,2003,硕士.
[4]蔡文涛.Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶通过调节相关凋亡因子的表达抑制骨肉瘤MG-63细胞凋亡的机制[D].南方医科大学,外科学,2014,博士.
[5]方墨人,田庆久,李英成,郭童英.青藏高原MODIS图像冰雪信息挖掘与动态监测分析[J].地球信息科学,2005,04:10-14.
[6]王永敏.脚踏式下肢康复训练机器人的研究与实现[D].河北工业大学,机械工程,2013,硕士.
[7]杨金岳.AT供电方式牵引网行波故障测距研究[D].华东交通大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[8]陈小康.媒介人力资源的管理绩效考评体系研究[D].安徽大学,传播学,2013,硕士.
[9]曾文秀.静动力排水固结法处理超软土地基最佳冲击能研究[D].广东工业大学,岩土工程,2014,硕士.
[10]王秀锋.MgO纳米带的制备与特性研究[D].天津理工大学,2014.
[11]刘昕.万海房地产公司购物大厦建筑项目成本控制研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[12]徐照营.电场差分法[J].石油地球物理勘探,1994,02:139.
[13]葛晨霞,益昭.商业银行CRM的需求分析和系统实现[J].华南金融电脑,2003,11:75-77.
[14]周宇,叶庆卫.多表关联的关联规则提取SQL实现[J].计算机应用研究,2002,08:132-133+137.
[15]张苗.基于模型的软件测试用例自动生成的研究[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[16]孙政.面向控制网络协议安全隔离平台的设计与实现[D].西南交通大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[17]朱瑞龙.青少年原发性精索静脉曲张外科治疗的临床研究[D].南方医科大学,泌尿外科,2012,硕士.
[18]敖毅斌.HI公司基于供应链管理环境下的供应商管理研究[D].浙江工业大学,工商管理,2012,硕士.
[19]刘莹莹.骨桥蛋白促进肝干细胞/肝前体细胞增殖和迁移的研究[D].第二军医大学,肿瘤学,2013,硕士.
[20]马延平.阳光银行合规风险管理问题研究[D].东北大学,工商管理,2009,硕士.
[21]齐晓慧,王俭臣,单甘霖.基于ESO迭代学习算法的故障估计[J].控制与决策,2015,03:546-550.
[22]刘国俊.A公司房地产项目营销策略研究[D].湖南师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[23]陈伟.白光LED用新型Ce：YAG单晶荧光材料制备及显色性能研究[D].郑州大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[24]赵志明,邓又明,王辉艳.浅谈数据挖掘技术原理及应用[J].吉林省经济管理干部学院学报,2004,04:52-53.
[25]马扬.一种列车用V型百叶窗气粒分离特性的数值模拟[D].湖南大学,供热、供燃气、通风与空调工程,2003,硕士.
[26]卢阳阳.生活污水同步硝化反硝化脱氮研究[D].北京交通大学,2014.
[27]赵佐华,黄寒星,王红强,张磊,王志洪,冯崎鹏,钟新仙.高性能聚苯胺/石墨烯复合材料的制备及在超级电容器中的应用[J].化工新型材料,2013,05:163-165.
[28]周黔,吴铁军.一种动态数据流的实时趋势分析算法[J].控制与决策,2008,10:1182-1185+1191.
[29]周文涵.探究式学习在高中英语阅教学中的应用研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[30]赵素燕.基于Lucene的电子公文全文检索系统研究与实现[D].北京交通大学,2015.
[31]张冠卿.思想政治课培养学生社会公德意识的策略研究[D].河北师范大学,教育,2014,硕士.
[32]王斌.我国政府食品安全监管问题研究[D].北京交通大学,2006.
[33]罗晓龙.车载天线倒伏装置传动系统零部件的设计与分析[D].广西科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[34]刘国兴.饥饿、盐度和密度胁迫对克氏原螯虾行为和生理功能的影响[D].扬州大学,水生生物学,2011,硕士.
[35]韩玉洁.新型石墨烯纳米杂化材料的合成及其分析应用[D].山西大学,2013.
[36]郭新柳.论伊恩·麦克尤恩小说对哥特文学传统的继承与发展[D].华中师范大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[37]董延龙.地震作用下高铁的车桥耦合振动分析[D].华中科技大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[38]王青.新时期高职院校学生管理的思考[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[39]王广伟.教室的室内定位系统的设计与开发[D].华东师范大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[40]王梦凡.基于布鲁姆过滤器的P2P多关键字搜索技术研究[D].湖南大学,软件工程,2012,硕士.
[41]姚雯,邱岭.1000MW机组厂用电系统电压及接线选择[J].电力系统自动化,2006,23:101-103.
[42]刘海军,徐友海,张代佳,修志龙.两步发酵法生产1，3-丙二醇的研究[J].食品与发酵工业.2006(02)
[43]王敏.南宋蒙古语借词考论[D].内蒙古师范大学,汉语言文字学,2012,硕士.
[44]韩晓红.状态方程混合规则及混合制冷剂相平衡研究[D].浙江大学,2005.
[45]于芳.汉英“脑”词群隐喻认知对比研究[D].上海外国语大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[46]王铮.初中口语交际教学研究[D].渤海大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[47]邓勇.含风电场的电力系统机组优化调度研究[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[48]庞桂喜.K（Q，σ）上的高斯扩张[D].广西师范大学,基础数学,2013,硕士.
[49]郭梅.基于MVC模式Web应用框架的研究与应用[D].河海大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[50]贾晓静.新课改视野下小学音乐教师专业发展研究[D].宁夏大学,音乐课程与教学论,2014,硕士.
