TGFβ1抑制miR-141上调HIPK2促进肾小管上皮细胞转分化

【摘要】背景：随着社会经济的发展和人们生活方式的改变,人类疾病谱正在发生变化,慢性肾脏病(chronickidneydisease,CKD)已呈现流行特征。CKD具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病而导致病死率和致残率高等特点,目前已成为影响我国国民健康的主要疾病之一。肾小管间质纤维化是各种原因引起的CKD发展到终末期肾衰竭的共同归路,而上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是导致肾小管间质纤维化中心环节之一。寻找一种新的有效、可行、副作用小的CKD治疗方法,将在很大程度上改变CKD患者的治疗现状。随着分子生物学和遗传学的发展,CKD的靶向治疗成为目前研究的焦点。MicroRNA(miRNA)是一类存在于病毒和高等生物中,进化上高度保守的内源性非编码RNA。miRNA广泛参与调控包括个体生长发育、细胞凋亡、增殖及分化在内的许多生命过程。近来发现miRNA与纤维化有非常密切的关系。目的：目前,已在多种纤维化中发现miR-141家族表达异常,其中有报道miR-141在多种纤维化中显著低表达并具有抑制TGFβ1诱导的EMT进程的作用。通过软件预测和荧光定量PCR验证,发现miR-141可靶向调控HIPK2表达,同时,有报道指出,HIPK2在人肾纤维化的EMT过程中起重要作用,而靶向调控HIPK2的miRNA却鲜有报道。本课题拟研究miR-141通过靶向调控HIPK2抑制肾小管上皮细胞HK2中TGFβ1诱导的EMT进程,以期为寻找肾纤维化的防治靶标提供坚实理论基础。方法：1、用不同浓度的TGFβ1处理HK2细胞48h,用real-timePCR检测miR-141的表达以及HIPK2mRNA的表达,Westernblot检测HIPK蛋白的表达；2、用2ng/ml的TGFβ1处理HK2细胞不同的时间,以real-timePCR检测miR-141的表达以及HIPK2mRNA的表达,Westernblot检测HIPK蛋白的表达；3、利用miR-141模拟物以及miR-141Sponge载体转染HK2细胞,用real-timePCR检测miR-141的表达以及HIPK2mRNA的表达,Westernblot分析HIPK蛋白的表达；4、利用双荧光素酶报告基因进一步验证miR-141对HIPK2的靶向调控作用；5、TGFβ1与miR-141联合处理HK2细胞,Westernblot检测EMT标志因子Vimentin、FSP-1和E-cadherin的表达；6、构建HIPK2过表达载体,与miR-141共转染HK2细胞,Westernblot检测EMT标志因子Vimentin、FSP-1和E-cadherin的表达。结果：1、随着TGFβ1处理浓度和处理时间的增加,real-timePCR结果显示,miR-141表达逐渐下调,HIPK2mRNA表达逐渐上调,HIPK且Westernblot结果显示,HIPK2蛋白表达逐渐上调；2、随着TGFβ1处理时间的增加,real-timePCR结果显示,miR-141表达逐渐下调,HIPK2mRNA表达逐渐上调,且Westernblot结果显示,HIPK2蛋白表达逐渐上调。当TGFβ1浓度为2ng/mL处理时间为2天时,HIPK2mRNA和蛋白与未处理细胞相比分别上调1.4和1.7倍,通过t检验,p值分别为0.0018和<0.0001,而miR-141下调40%,t检验得到p值为0.0054,均有统计学意义；3、miR-141模拟物转染HK2细胞时,miR-141过表达,HIPK2表达收到抑制；而miR-141Sponge载体转染HK2细胞时,miR-141被沉默,HIPK2表达上调。经t检验,p值分别为0.0006和0.0005,具有统计学意义；4、双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-141可靶向抑制HIPK2的表达,与对照组相比,miR-141转染组和miR-141Sponge转染组均有显著变化,p值均小于0.0001；5、TGFβ1可上调HIPK2,Vimentin和FSP1的表达,与对照组相比,p值分别为0.0002,0.0003和0.0011,下调E-cadherin的表达,与对照组相比,p值为0.0002；miR-141可抑制HIPK2,Vimentin和FSP1的表达,与对照组相比,p值分别为<0.0001,0.0001和0.0002；上调E-cadherin的表达,与对照组相比,p值为0.0007。TGFβ1和miR-141联合作用可逆转TGFβ1对HIPK2,Vimentin和FSP1的上调作用,与TGFβ1组相比,p值分别为0.0030,0.0004和0.0013；以及可逆转对E-cadherin的抑制作用,与TGFβ1组相比,p值分别为0.0005;6、HIPK2可上调Vimentin和FSP1的表达,与对照组相比,p值分别为0.0113和0.0087,下调E-cadherin的表达,与对照组相比,p值为0.0001；miR-141可抑制Vimentin和FSP1的表达,与对照组相比,p值分别为0.0002和0.0003；上调E-cadherin的表达,与对照组相比,p值为0.0021。miR-141和HIPK2联合作用可逆转miR-141对Vimentin和FSP1的抑制作用,与miR-141转染组相比,p值分别为0.0003和<0.0001；以及可逆转对E-cadherin的上调作用,与miR-141转染组相比,p值为0.0022。结论：1、TGFβ1可下调miR-141而上调HIPK2表达；2、miR-141可靶向抑制HIPK2的表达；3、TGFβ1可通过抑制miR-141而调控EMT进程；4、miR-141可通过抑制HIPK2而调控EMT进程；5、miR-141通过靶向抑制而HIPK2调控TGFβ1介导的肾纤维化EMT进程。
【作者】黄远航；
【导师】陈政良；
【作者基本信息】南方医科大学，免疫学，2014，博士
【关键词】miR-141；HIPK2；肾纤维化；EMT；

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