非小细胞肺癌新的治疗性靶点的探索

【摘要】近年来,肺癌的发病率和死亡率明显上升,已成为全球及我国死亡率最高的恶性肿瘤[1,2]。以手术、放疗、化疗和分子靶向治疗为主的综合治疗是肺癌最主要的治疗手段。我国肺癌的治疗取得了很大的进步。自2003年开始我国颁布了多个肺癌的临床诊疗规范,包括卫生部颁布的“原发性肺癌诊疗规范”和NCCN指南（NationalComprehensiveCancerNetwork）中国版。多项研究显示根据指南治疗可以提高肺癌患者的生存[3-5]。但是,由于我国地域辽阔、人口众多、社会经济及文化的差异,治疗存在不平衡性。我们对广东省肺癌研究所（GuangdongLungCancerInstitute,GLCI）门诊数据库2004年10月至2013年1月共收录2535名肺癌患者的数据进行分析,结果显示肺癌的组织学构成发生了明显的改变,肺鳞癌的比例逐渐下降（14.1%,358/2535）、肺腺癌比例增加（62.8%,1592/2535）。且非吸烟肺癌患者增加（48.2%,1222/2535）,这个结果说明除了吸烟以外的致癌因素在肺癌的发生过程中起到了越来越重要的作用。大部分早期NSCLC（非小细胞肺癌,non-smallcelllungcancer）患者接受了手术治疗,分别有14.6%和32.4%的IA期和IBNSCLC患者接受了围手术期化疗。ⅢA期NSCLC患者接受手术治疗的比例高,接受同步放化疗或序贯放化疗的比例低。一线接受EGFR（表皮生长因子受体,EpidermalGrowthFactorReceptor）TKIs（酪氨酸激酶抑制剂,TyrosineKinaseInhibitors）治疗的患者中约一半为EGFR突变型。接受二线化疗和三线化疗的NSCLC患者中,分别有38.3%（172/449）和49.2%（63/128）的患者接受了含铂双药化疗。我们对有生存数据的727名NSCLC患者进行分析,这些患者的2年生存率和5年生存率分别为38%和16%。肺癌患者的生存率仍然很低,在进一步规范治疗的同时,需要寻找新的治疗方法。含铂双药化疗是晚期NSCLC的标准一线治疗,然而其RR（responserates,有效率）仅17%～32%,PFS（progression-freesurvival,至疾病进展时间）为3-6个月,OS（overallsuvival）为7-11个月[6-9]。化疗在晚期NSCLC患者中的作用已达到平台。近年来肺癌治疗的进步很大程度得益于驱动基因的发现,尤其是EGFR基因突变、ALK基因（间变性淋巴瘤激酶,AnaplasticLymphomaKinase）融合等驱动基因及相应靶向药物的成功使用[10,11]。但我国仍有约一半的NSCLC患者并没有检测到目前已知的驱动基因变异,尤其是在肺鳞癌中,大部分的驱动分子突变和融合基因都不清楚[12]。对NSCLC新的治疗靶点的探索主要有两条策略：其一是探寻新的驱动基因；其二是为尚无特异性靶向药的已知驱动基因寻找有效的靶向药物。全转录组测序技术能够在分析转录本的结构和表达水平的同时,发现融合基因和未知的转录本,精确地识别可变剪切位点以及SNV,提供最全面详细的转录组信息。鉴于潜在具有恶性转化能力的驱动基因与肺癌关系密切,但目前了解甚少,缺乏对肺鳞癌的融合基因谱的全面分析。因此在实验的第一部分我们拟采用转录组深度测序技术分析肺鳞癌组织中的融合基因序列信息,鉴定可能成为肺鳞癌驱动基因的融合基因。KRAS基因突变是NSCLC一个常见的分子亚型,在西方和中国NSCLC人群中分别占到了20%和5.1%[13]。KRAS突变的NSCLC患者的预后差,是肺癌独立的预后因子。研究发现,在部分NSCLC患者中存在RAS信号通路的激活。但是,目前尚无特异性的直接针对KRAS的抑制剂,对KRAS突变的NSCLC患者无有效的靶向治疗。在2013年的一项研究显示,靶向KRAS下游分子MEK的抑制剂与多西他赛连用在KRAS突变的NSCLC中显示了喜人的疗效,但增加了副反应的发生[14]。细胞增殖依赖于还原型叶酸,它是细胞合成和修复DNA所必须的物质。培美曲塞是多靶点的叶酸抑制剂,通过抑制叶酸代谢途径中的3个关键酶–胸苷酸合成酶（TS）,二氢叶酸还原酶（DHFR）、甘氨酰核苷酸甲酰基转移酶（GARFT）的活性,抑制嘧啶和嘌呤的合成,从而阻断DNA和RNA的合成[15]。培美曲塞通过运载叶酸的载体与细胞膜的叶酸结合蛋白运输系统进入细胞。然后在叶酰多谷氨酸合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式。多谷氨酸化在肿瘤细胞内呈时间-浓度依赖性,但在正常细胞内浓度很低,因此培美曲塞副反应小。另外,多谷氨酸化代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长,从而延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。基础研究发现KRAS突变的NSCLC对培美曲塞敏感,可能是通过上调microRNA-181c的水平,来下调KRAS[16]。另一项培美曲塞联合索拉非尼治疗NSCLC的研究中发现,培美曲塞序贯索拉非尼具有协同作用,其原因是由于索拉非尼可以抑制由培美曲塞激活的MAPK信号通路[17]。在实验的第二部分,我们旨在探讨培美曲塞联合AZD6244对KRAS突变NSCLC细胞的抑制作用及其机制。第一部分非小细胞肺癌新融合基因的鉴定方法从广东省肺癌研究所标本库选取10例未接受任何治疗的ⅢA期肺鳞癌手术标本。首先用免疫组化冰冻切片仪切片,HE染色后进行病理评估。确定组织类型为肺鳞癌以及组织中的肿瘤细胞≥70%。抽提组织样本的总RNA,用紫外分光光度计、Agilent2100analyzer和凝胶电泳进行质量和浓度的鉴定。先检测EGFR、KRAS基因突变和ALK基因融合,用于在转录组测序前排除潜在的已知驱动基因的变异。随后用Hiseq2000测序平台进行转录组测序。数据分析：首先用SolexaQA软件对原始测序数据进行Q30统计和测序长度过滤。然后用TopHat软件,快速的将测序数据比对到人参照基因组hg19上,然后分析鉴别外显子间的剪接点。Cufflinks软件计算转录本的丰度,同时还能检测样本间的差异表达及可变剪接。Samtool将SAM格式的数据转成BAM格式的数据,然后对其进行排序,合并、索引。然后用ANNOVAR软件通过关联到多个数据库进行功能注释。用DeFuse和TopHat两个软件进行融合基因的分析。最后对测序结果分析得到的融合基因采用RT-PCR和直接测序法进行验证,对经过验证的融合基因进行扩大样本的筛查,在其相应的正常组织以及筛选的20例肺鳞癌肿瘤组织进行RT-PCR和测序。结果1.对10例肺鳞癌肿瘤组织进行Hiseq2000全转录组测序,Q30均高于85%,每个标本能比对到hg19的碱基数大于5Gb。2.10个肺鳞癌标本发现了大量的SNV,平均每个标本80273个,平均12.15个/Mb。这些SNV分布在不同的区域,也导致了不同类型的氨基酸变异。6种碱基转换（transition）和颠换（transversion）在非吸烟标本GLCI1和GLCI3与其他8例吸烟标本（GLCI2、GLCI4、GLCI5、GLCI6、GLCI8、GLCI9、GLCI10）中最常见的类型均是C:G-T:A和A:T-G:C。3.对比吸烟和非吸烟组的基因表达量,由Cuffdiff软件得到差异表达的基因,非吸烟标本和吸烟标本之间未见聚类。4.由Defuse软件进行融合基因的分析,平均每个标本鉴定出97个融合基因,其中有50个融合基因分别在4个或4个以上的标本中同时出现。5.用TopHat软件进行融合基因的分析,在10例标本中一共筛选出132个融合基因,70.5%（93/132）为同一染色体内的基因融合。根据软件给出的3类证据：1.跨融合点的reads数,要求融合点两侧必须能够匹配15bp；2.由于是paired-end测序,因此第2类证据为在融合点两侧的reads对数；3.Matepair的reads中,一个read跨过融合点,另一个read在融合点附近。根据这3点,我们挑出支持reads数多的26个融合基因进行验证。采用RT-PCR后直接测序的方法,用Chromas2.22软件进行比对,一共验证出20个融合基因,验证率达到76.9%。6.在验证出的20个融合基因中,有5个融合基因（ECE2-PSMD2、ARHGAP42-TMEM123、WWTR1-AGTR1、TNFSF10-FXR1、FAM38A-APRT）属于框内融合（in-framefusion）,对发现这5个融合基因肺鳞癌患者相应的正常组织进行RT-PCR及直接测序法测序,发现在GLCI6号患者的正常肺组织中也存在ECE2-PSMD2基因融合,未在相应的正常组织中检测到其余4个融合基因。7.在另外20例肺鳞癌标本中用RT-PCR结合直接测序法未检测到这5个融合基因的存在。结论1.对10例未经治疗的ⅢA期肺鳞癌患者手术标本进行全转录组测序,数据质量高,Q30均高于85%；2.研究发现肺鳞癌存在大量SNV,平均12.15个/Mb,单碱基变异在非吸烟标本与吸烟标本中未见明显差异,最常见的类型是C:G-T:A和A:T-G:C,与肺腺癌不同；3.Defuse软件进行融合基因的分析,平均每个标本鉴定出97个融合基因,其中有50个融合基因分别在4个或4个以上的标本中同时出现；4.TopHat软件在10例标本中一共筛选出132个融合基因,70.5%为同一染色体内的基因融合,根据其提供的3类证据的高低,在26各融合基因中共验证出20个融合基因,验证率达到76.9%；5.在验证出的20个融合基因中,对存在5个框内融合基因肿瘤组织相应的正常组织进行RT-PCR及直接测序法测序,发现在GLCI6号患者的正常肺组织中也存在ECE2-PSMD2基因融合,未在相应的正常组织中检测到其余4个融合基因。第二部分AZD6244联合培美曲塞对KRAS突变非小细胞肺癌细胞的抑制作用的初步研究方法首先用含5%dialyzed胎牛血清的培养液培养11株KRAS突变的NSCLC细胞株。选取Calu-6和H2009两个细胞株,分为AZD6244与培美曲塞同步、AZD6244序贯培美曲塞和培美曲塞序贯AZD6244三种治疗模式,用MTS检测药物对细胞增殖的影响。然后在多个细胞株中重复实验验证其有效性。用Westernblot检测单药和两药同步以及序贯治疗后细胞重要蛋白的变化,包括TS、pRB、pERK以及凋亡相关蛋白。最后用平板克隆形成实验检测两药联用对细胞克隆形成能力的影响。所有数据应用SPSS13.0进行统计分析。计量资料均采用均数±标准差表示。首先对数据进行正态分布及方差齐性检验。细胞增殖实验不同组间细胞增殖差异的比较采用析因设计的方差分析,数据满足正态分布方差齐者,各组间两两LSD法；方差不齐者,各组间的增殖差异采用Tambane’sT2法,P<0.05为有统计学意义。结果1.在Calu-6和H2009两个KRAS突变的NSCLC细胞株中,培美曲塞序贯AZD6244和同步给予培美曲塞联合AZD6244较单药能更好的抑制细胞增殖。在同步治疗模式中,联合组与培美曲塞单药相比对细胞增殖的影响差异有统计学意义；在培美曲塞序贯AZD6244治疗模式中,序贯治疗与AZD6244单药相比对细胞增殖的影响差异有统计学意义。2.多个KRAS突变NSCLC细胞株中,培美曲塞序贯AZD6244在部分KRAS突变NSCLC细胞株中具有协同作用,部分细胞株未见协同作用。在H2009、H157、A549、H1792、Calu-15个KRAS突变的NSCLC细胞中,不同浓度的序贯组较单药AZD6244相比较对细胞增殖的影响差异有统计学意义（P<0.001）,与生长曲线图的结果一致。而在H460、Calu-6、A427、H2887、H23细胞株中,部分浓度的培美曲塞序贯AZD6244对细胞增殖的影响差异有统计学意义,但结合它们的生长曲线图,这5株细胞株并没有曲线明显左移,没有协同作用。我们根据细胞对培美曲塞序贯AZD6244治疗KRAS突变的NSCLC细胞株是否具有协同作用,将其分为两组：敏感细胞株：H157、H2009、A549、H1792、Calu-1;不敏感细胞株：H460、Calu-6、A427、H2887、H23。其中最为敏感的依次是H157、H2009、A549细胞株。3.用Westernblot检测蛋白水平的变化,AZD6244可下调KRAS突变NSCLC细胞株TS、pRB和pERK的蛋白水平,且随着药物浓度的增加蛋白表达逐渐下降；培美曲塞可以上调pERK、TS、pRB蛋白水平,随着浓度的增加而表达增加,药物处理48h蛋白变化最明显；与两药同步处理相比,对培美曲塞序贯AZD6244治疗敏感的细胞株的pERK、TS、pRB以及凋亡相关的蛋白水平下调更明显。4.平板克隆形成实验中,两药同时处理或培美曲塞序贯AZD6244处理KRAS突变的NSCLC细胞较单药具有更明显的抑制效应,但未见明显的协同作用。结论1.培美曲塞序贯AZD6244在部分KRAS突变的NSCLC细胞株（H2009、H157、A549、H1792、Calu-1）中具有协同作用,而在H460、Calu-6、A427、H2887、H23细胞株中未见协同作用；2.AZD6244可下调TS、pRB和pERK的蛋白表达水平,且随着药物浓度的增加抑制程度更明显,培美曲塞可上调pERK、TS和pRB蛋白表达水平,且随着药物浓度的增加而增强；3.与两药同步处理相比,对培美曲塞序贯AZD6244治疗更敏感的细胞株的pERK、TS、pRB以及凋亡相关蛋白的表达水平下调更明显；4.在平板克隆形成实验中,用培美曲塞序贯AZD6244处理KRAS突变的NSCLC细胞株并未看到两药明显的协同作用。
【作者】杨露璐；
【导师】吴一龙；
【作者基本信息】南方医科大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】非小细胞肺癌；转录组测序；融合基因；AzD6244；培美曲塞；KRAs突变；

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