黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌进展的影响及机制

【摘要】肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一,也是对人类生存和健康构成极大威胁的恶性肿瘤。在我国,肺癌也已成为恶性肿瘤的头号杀手。吸烟是肺癌发病的一个重要诱因,大约80%的男性患者和50%的女性患者都有吸烟史。中国疾病预防控制中心等部门发布的《控烟与中国未来》显示,2002年至2010年中国烟民的数量一直保持在3亿以上。到2030年,中国因吸烟而导致的年死亡人数将达到300万,占40岁以上人群死亡归因总数的25%。因此,对吸烟诱发的肺癌的防治是目前研究的重点。尼古丁是烟草中的主要成瘾性组分,其能诱导肿瘤细胞增殖,促进肿瘤血管生成,促进肿瘤的侵袭转移,通过多种途径加速肺癌的发生发展。中国传统医学虽无肺癌这一病名,但古代医家对其症状、病因、病机等早有描述,并认为“烟为辛热之魁”,火热是烟致肺积的重要病机。中医药治疗肺癌具有缓解症状、改善生存质量、延长生存期、配合放化疗减毒增效以及防止转移的作用。黄芩是传统的清热中药,具有清热燥湿、泻火解毒等功效。黄芩中主要的黄酮类组分黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素具有广泛的抗肿瘤活性。现已发现黄芩黄酮类组分对多种肺癌细胞株均有抑制作用,但黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌进展的影响尚未见报道。为此本研究将就黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌进展的作用及机制进行研究,并以补肾组分淫羊藿苷作为对照,将为黄芩黄酮类组分抗肿瘤的临床应用提供客观而科学的理论基础和实验依据,并为肺癌的临床治疗提供新的有效药物和优选方案,从而为肺癌的临床治疗开辟新的有效途径。本课题研究内容分为三部分。第一部分黄芩黄酮类组分对人肺癌A549细胞和H1299细胞增殖和凋亡的影响目的1.观察黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的人肺癌细胞株A549和H1299的生物学效应；2.探讨黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的人肺癌细胞株A549和H1299凋亡的作用机制。方法1.将人肺癌细胞株A549和H1299细胞分别暴露于尼古丁(终浓度为10-8M和10-6M)和不同浓度的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和淫羊藿苷(终浓度为501μM、10μM、1μM和10μM)中,观察黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的A549细胞和H1299细胞形态学的影响,以CCK-8法检测黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的A549细胞和H1299细胞增殖的影响,以流式细胞术观察黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的A549细胞和H1299细胞凋亡的影响；2.以Real-timePCR法和Westernblot法检测尼古丁诱导的人肺癌细胞株A549细胞和H1299细胞中凋亡相关基因和蛋白bcl-2、bax和pro-caspase3的变化情况,以进一步明确黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的人肺癌细胞株A549细胞和H1299细胞凋亡的作用机制。结果1.黄芩黄酮类组分能显著抑制尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和H1299细胞增殖,尤以黄芩素和汉黄芩素作用更为显著。黄芩黄酮类组分作用后的A549细胞和H1299细胞呈现细胞凋亡的典型表现,AnnexinV联合PI法染色结果进一步明确了黄芩黄酮类组分的促凋亡作用,黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的A549细胞的早期凋亡率分别是6.90±0.40、19.63±1.23和22.5±3.22,对尼古丁诱导的H1299细胞的早期凋亡率分别是11.82±2.73、14.04±4.27和12.55±2.74,与尼古丁组均有显著性差异。而淫羊藿苷不能抑制尼古丁诱导的H1299细胞增殖和凋亡,早期凋亡率与尼古丁组无显著性差异；2.黄芩黄酮类组分作用于人肺癌A549细胞48h后,黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素可显著抑制bcl-2mRNA和蛋白表达,黄芩苷显著抑制baxmRNA表达,但对bax蛋白表达无影响,汉黄芩素显著促进baxmRNA表达,黄芩素和汉黄芩素均促进bax蛋白表达,黄芩素和汉黄芩素显著抑制bcl-2/baxmRNA比值和pro-caspase-3mRNA表达,三者均显著抑制bcl-2/bax和pro-caspase-3蛋白表达。黄芩黄酮类组分作用于人肺癌H1299细胞48h后,黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素可显著抑制bcl-2、bax和pro-caspase-3mRNA和蛋白表达,黄芩素显著抑制bcl-2/baxmRNA比值,但三者均对bcl-2/bax蛋白比值无影响。淫羊藿苷可促进bcl-2mRNA表达,但对baxmRNA、caspase-3mRNA和bcl-2/baxmRNA比值以及凋亡相关蛋白表达无影响。第二部分黄芩黄酮类组分对人肺癌A549细胞和H1299细胞侵袭转移和炎症微环境的影响目的1.观察黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌侵袭转移的影响；2.观察黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌炎症微环境的影响；3.探讨黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌侵袭转移和炎症微环境的影响机制。方法1.采用细胞划痕实验研究黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和淫羊藿苷(终浓度为54μM、10μM、1μM和10μM)对尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和H1299细胞迁移的影响。采用Transwell侵袭实验研究黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和H1299细胞侵袭能力的影响；2.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)研究黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和H1299细胞TNF-a和IL-6的影响；3.采用Real-timePCR法和Westernblot法检测黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的人肺癌细胞株A549细胞和H1299细胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65和IκB-αmRNA和蛋白的影响。结果1.黄芩黄酮类组分能显著抑制尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和H1299细胞侵袭转移,尤以黄芩素和汉黄芩素作用更为显著。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素均显著下调A549细胞和H1299细胞的侵袭转移相关基因MMP-2和MMP-9mRNA表达,黄芩素和汉黄芩素明显抑制A549细胞的MMP-2和MMP-9蛋白表达,三种黄芩黄酮类组分均明显抑制H1299细胞的MMP-2和MMP-9蛋白表达。淫羊藿苷不能抑制尼古丁诱导的H1299细胞侵袭转移,对MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白表达亦无影响；2.黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的两种肺癌细胞株的炎症微环境具有显著地抑制作用。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素均能抑制A549细胞IL-6和TNF-α表达和H1299细胞TNF-α表达,黄芩苷和黄芩素能抑制H1299细胞IL-6表达。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素均抑制A549细胞和H1299细胞中NF-κBp65mRNA和蛋白表达,上调H1299细胞的IκB-αmRNA和蛋白表达,但对A549细胞的IKB-αmRNA和蛋白表达无影响。淫羊藿苷不能抑制尼古丁诱导的H1299细胞TNF-α和IL-6表达,对H1299细胞的NF-κBp65和IκB-αmRNA和蛋白表达亦无影响。第三部分黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的小鼠Lewis肺癌移植瘤的作用及机制目的探讨黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑瘤作用及其机制。方法1.60只C57小鼠接种Lewis肺癌细胞,一周后将荷瘤鼠随机分为6个组,每组10只：对照组、尼古丁组、尼古丁+黄芩苷80mg/kg组、尼古丁+黄芩素40mg/kg组、尼古丁+汉黄芩素40mg/kg组和尼古丁+淫羊藿苷50mg/kg组。从分组后一周开始除对照组和尼古丁组给予生理盐水灌胃外,其余各组给予相应药物灌胃,每天1次,共28天。从分组后两周开始除对照组外,其余各组给予尼古丁1mg/kg腹腔注射,每周3次,共3周。末次用药后处死小鼠,处死前用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b),计算瘤体体积V=a×b2/2。处死后小心剥离种植瘤,将瘤体称重。2.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)研究黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的Lewis肺癌小鼠移植瘤的VEGF、TNF-a和IL-6的影响；3.采用Westernblot法检测黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的Lewis肺癌小鼠移植瘤的bcl-2、bax和caspase-3蛋白表达的影响；4.采用免疫组织化学法检测黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的Lewis肺癌小鼠移植瘤的CD31和NF-κBp65表达的影响,通过CD31表达计算肿瘤微血管密度(MVD)。结果1.黄芩黄酮类组分可显著抑制尼古丁诱导的肺癌移植瘤增殖,尤以黄芩素和汉黄芩素作用更为显著。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素均能抑制尼古丁诱导的凋亡转移相关蛋白bcl-2和caspase-3表达,下调bcl-2/bax比值,汉黄芩素能促进尼古丁诱导的bax蛋白表达。淫羊藿苷虽能抑制bc1-2表达,上调bax表达,下调bcl-2/bax比值,但不能抑制caspase-3表达,对尼古丁诱导的瘤体积和瘤重无影响；2.汉黄芩素能显著抑制尼古丁诱导的肺癌移植瘤的微血管生成,而黄芩素对尼古丁诱导的肿瘤新生血管形成无影响,黄芩苷则促进尼古丁诱导的肿瘤微血管生成。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素均能显著抑制尼古丁诱导的肺癌移植瘤的VEGF表达。淫羊藿苷虽可抑制尼古丁诱导的肿瘤微血管密度,但对VEGF表达无影响；3.黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌移植瘤的炎症微环境具有显著地抑制作用。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素均能抑制IL-6表达,黄芩苷和黄芩素能抑制TNF-α表达。三种黄芩黄酮类组分均能抑制瘤组织中NF-κB表达。淫羊藿苷虽能抑制尼古丁诱导的瘤组织NF-κB表达,但对IL-6和TNF-α表达无影响。结论1.黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和H1299细胞均有明显的抑制作用,尤以黄芩素和汉黄芩素作用更为显著。黄芩黄酮类组分可显著抑制尼古丁诱导的凋亡相关基因和蛋白Bcl-2表达,上调Bax表达,降低bcl-2/bax比值,下调Pro-caspase-3的表达,启动线粒体凋亡途径,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。2.黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的人肺癌A549细胞和+1299细胞的转移侵袭均有显著地抑制作用,尤以黄芩素和汉黄芩素作用更为显著,其机制可能与下调侵袭转移相关基因和蛋白如MMP-2和MMP-9的表达有关。3.黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的A549细胞和H1299细胞的炎症微环境具有显著地抑制作用,表现为抑制IL-6和TNF-α表达,其机制可能与抑制两种细胞的NF-κBp65蛋白表达,上调H1299细胞的IκB-α蛋白表达有关。4.黄芩黄酮类组分可显著抑制尼古丁诱导的肺癌移植瘤增殖,尤以黄芩素和汉黄芩素作用更为显著,其机制可能与下调凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3表达,下调bcl-2/bax比值,最终导致黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌移植瘤的促凋亡作用有关。黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对尼古丁诱导的肺癌移植瘤的微血管生成的作用分别为促进、无影响和抑制,但三者均能显著抑制尼古丁诱导的肺癌移植瘤的VEGF表达。此外,黄芩黄酮类组分对尼古丁诱导的肺癌移植瘤的炎症微环境具有显著地抑制作用,表现在抑制IL-6和TNF-α表达,其机制可能与抑制瘤组织中NF-κB表达有关。5.在体外实验中,淫羊藿苷不能抑制尼古丁诱导的H1299细胞增殖及细胞凋亡,亦对凋亡下游信号无影响；淫羊藿苷不能抑制尼古丁诱导的H1299细胞侵袭转移,亦对MMP-2和MMP-9表达无影响；不能抑制尼古丁诱导的IL-6和TNF-α表达,对NF-κBp65和IκB-α表达的影响与尼古丁组亦无影响。在体内实验中,淫羊藿苷虽能抑制bcl-2表达,上调bax表达,下调bcl-2/bax比值,但不能抑制caspase-3表达,对尼古丁诱导的瘤体积和瘤重无影响。淫羊藿苷虽可抑制尼古丁诱导的肿瘤微血管密度,但对VEGF表达无影响。此外淫羊藿苷虽能抑制尼古丁诱导的NF-κB表达,但对IL-6和TNF-α表达无影响。
【作者】弓唯一；
【导师】董竞成；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合，2013，博士
【关键词】黄芩素；黄酮类成分；人肺癌细胞株；细胞调亡；淫羊藿苷；caspase；抑制作用；凋亡相关蛋白；移植瘤组织；作用机制；

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