金属蛋白酶ADAMTS-7在肺动脉高压发病机制中的作用研究

【摘要】背景：肺动脉高压(Pulmonaryarterialhypertension,PAH)在临床是一种多因素参与的病理生理过程,可由多种疾病引起共有的常见综合征,是严重的、具有潜在破坏力的慢性肺循环疾病,是以肺小动脉的血管痉挛、内膜及中膜增生和重构为主要特征的一种疾病。临床表现主要有劳力性呼吸困难、气促、乏力、胸痛、晕厥等,患者最终往往死于右心衰竭。目前尚缺乏有效治疗方法,确诊后患者平均生存时间与恶性肿瘤不相上下,自然存活时间2.8年,预后极差。虽然近年来细胞分子生物学和遗传学的高速前进促进了肺动脉高压发病机制的研究,取得了一系列的研究成果,但目前认为,肺动脉高压的发病机制非常复杂,至今没有一个完整的阐述。到目前为止,其发生机制研究得出主要为：1、与Ⅱ型骨形成蛋白(BoneMorphogeneticProtein,BMP)受体(BMPR2)有关的基因异常突变；2、内皮系统受损及异常分泌；3、钾离子通道异常；4、炎症细胞的作用；5、基质金属蛋自酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)的上调。基质金属蛋白酶及其特异性抑制物(tissueinhibitorofmetallo-proteinases,TIMPs)在细胞处基质合成与降解的动态平衡中起着关键作用。在主动脉和冠状动脉壁病变中,基质金属蛋白酶的作用是研究热点。在肺动脉高压的研究中,早有专家研究显示MMP-1和MMP-2通过降解血管基底膜的胶原及变性胶原,后者又拮抗其它基质金属蛋白酶的降解,促进肺血管平滑肌的增殖与迁移,从而影响肺血管的结构重塑,参与各种肺动脉高压的形成。而TIMP-1是活性基质金属蛋白酶-1和-2的特异性抑制物,其可特异性的阻断后者与底物相结合,从而抑制相关胶原的降解过程,正常情况下,二者平衡维持稳态。布朗等证实一氧化氮的充分供给可以使基质金属蛋白酶抑制物质的分泌减少。动物研究显示,一氧化氮可通过TIMP-1/MMP-1平衡的调节来减少胶原的堆积,加强胶原的降解,从而影响肺血管重构。有人研究发现抑制基质金属蛋白酶可以明显降低肺动脉高压患者的肺动脉压力。肺动脉高压时平滑肌细胞增生,无肌化肺小动脉出现有肌化现象；严重肺动脉高压的肺动脉内皮细胞与内弹力板之间出现“新生内膜”,后者由肌纤维细胞及细胞外基质构成；内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞增殖与凋亡出现失平衡状态,导致肺动脉结构重构,最终形成肺动脉高压。在肺动脉高压血管重构过程中,首先是外膜成纤维细胞被激活增殖并合成基质成分；之后MMP2、MMP9等基质金属蛋白酶上调并介导成纤维细胞由外膜迁移进入血管中膜和内膜,再之出现肺血管中膜及内膜增生增殖、血管重构形成。含Ⅰ型血小板反应蛋白的解聚素和金属蛋白酶(adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs,ADAMTS)家族是一类新近被克隆的Zn依赖的分泌型金属蛋白酶家族,这个家族与基质金属蛋白酶家族及解聚蛋白样金属蛋白酶同属于金属蛋白酶家族,但由于其发现时间较晚(1997年),我们对它的了解远远不如后两个家族那么深入。该家族成员与基质金属蛋白酶家族一样,同样具有降解细胞外基质的能力。其于其它两个家族结构的主要不同点是羧基端含有至少一个TSP重复序列(又称之为TSP基序)。ADAMTS家族属于分泌型蛋白酶,可由体内多种细胞合成与分泌,如平滑肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等,其通常与基质相结合。其一共有19个家族成员组成,目前了解的较多是ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-9及ADAMTS-13这几个成员,它们通过对细胞外基质蛋白的降解或调节而参与了一系列的正常生理学功能,如发育、血管新生和凝血等。而它们的异常表达与细胞外基质蛋白相互作用后通常会引发各种疾病,如癌症、关节炎、动脉粥样硬化、皮肤脆性相关的疾病、凝血功能障碍性紫癜等疾病。而其更多的家族其它成员的功能仍不清楚,有待研究。其中ADAMTS家族的第七个成员——ADAMTS-7对血管方面的精细调节随着人们的深入研究而逐渐让人所知,通过其底物软骨寡聚基质蛋白(cartilageoligomericmatrixprotein,COMP)精细调控血管稳态。ADAMTS-7是1999年由HurskainenTL团队首先报道,其结构包括一个锌离子催化结构域和其他几个非催化结构域,包括：1个disintegrin结构域、1个thrombospondin结构域、1个cysteine-rich结构域(cysteine-richdomain,CRD)、1个spacer-1结构域、3个thrombospondinmotifs、1个spacer-2结构域和C-末端4个thrombospondinmotifs。ADAMTS-7其与家族成员ADAMTS-12同属ADAMTS家族一个亚型,可直接结合并降解软骨基质蛋白。近十年来国际上研究其较多的有刘传聚教授(现在美国纽约大学医学院系)和北京大学医学部的王利教授研究团队,其中刘教授对其研究主要是从关节炎及软骨发育这一领域,如其研究显示通过体外试验,发现在风湿性软骨滑膜炎病人过表达与降解COMP相关的ADAMTS-7明显升高。在关节炎病人中发现的COMP降解碎片与ADAMTS-7降解COMP的碎片相同。另外,通过应用ADAMTS-7的抗体则可明显的抑制软骨培养中的肿瘤坏死因子和白介素-1β诱导的COMP降解。用siRNA沉默技术抑制ADAMTS-7也可明显的阻止COMP的降解。王利研究团队研究ADAMTS-7从血管出发,这其中也涉及到从COMP入手,发现ADAMT-7可以通过调节COMP的降解而有可能促进血管平滑肌细胞钙化的作用,其发现miRNA-29可干预ADAMTS-7的下游反应,从而调节血管钙化；另外其还通过球囊损伤大鼠颈动脉模型发现ADAMT-7在血管平滑肌细胞的增殖与迁移中起重要作用；其研究认为ADAMTS-7可能参与了动脉粥样硬化中血管基质的降解和重塑,从而加速了动脉粥样硬化的进程。也有研究报道ADAMTS-7其还参与了血管损伤后内膜的增生。国内有专家对非ST段抬高型心肌梗死的血液进行了相关检测,显示ADAMTS-7的水平与NSTEMI患者远期预后密切相关。ADAMTS-7的信使RNA之前报道称其是由人THP-1的单核/巨噬细胞中的TNF-α上调的,但其调节的精细机制仍不清楚；在王利等的研究认为其可能的机制是通过转录因子NF-κB和AP-1来让TNF-α上调而刺激ADAMTS-7诱导大鼠平滑肌增殖。据研究报道,在成人样本中,通过检测分析ADAMTS-7,发现在心脏、胰腺、肾、骨骼肌和肝脏具有最高水平的表达,在大鼠肝脏、睾丸、肺、卵巢、肾、胚胎、心脏和胸腺组织中是均有不同程度地表达。在骨骼肌、半月板和脂肪也可较低水平的被检测到。但是在肺动脉高压疾病相关的肺组织中其表达情况暂时未见报道。基于以上资料,我们已明确肺动脉高压的发病机制非常复杂,具体机制仍不是很清楚,但可以肯定的是基质金属蛋白酶的异常表达是肺动脉高压重要发病机制之一,而ADAMTS这一家族金属蛋白酶与基质金属蛋白酶一样,同样具有降解细胞外基质的能力,同时又广泛分布于哺乳动物的大部分脏器内；而既往研究资料显示其中ADAMTS-7与血管发育关系密切,特别是与体循环的动脉粥样硬化关系密切,我们推测ADAMTS-7可能与肺循环也有密切联系,如能加以证实有望成为肺动脉高压治疗的新靶点。本课题拟先在成人肺动脉高压肺组织和正常肺动脉压力肺组织行ADAMTS-7检测,以明确ADAMTS-7有无在肺组织中表达,有无在肺动脉高压患者肺组织中表达。再进行肺动脉平滑肌细胞培养,进行TNF-α干预后检测ADAMTS-7在其中的表达,以及相关增殖、凋亡、炎症指标的变化。最后,我们在肺动脉高压大鼠中再进行相关检测验证。本研究三部分分述如下：第一部分轻中度肺动脉高压患者肺组织中的ADAMTS-7的表达情况目的：为明确ADAMTS-7在肺组织中的表达及肺动脉高压患者肺组织中的表达情况。方法：采用病例对照研究,随机选取在广东医学院附属医院住院并拟开胸手术患者,其中20例患者经右心导管测压显示有轻中度肺动脉高压,另20例患者肺动脉压力经右心导管检测正常。两组患者在手术中取1cm3肺组织,进行免疫组织化学法及免疫荧光RT-PCR法检测两组患者肺组织中ADAMTS-7的表达。结果：免疫组织化学法显示在正常压力对照组肺组织中可见少许ADAMTS-7的阳性表达,在肺动脉高压组肺组织中可见大量ADAMTS-7阳性表达,经图像分析软件计算并统计得出病例组IOD值明显高于对照组(P<0.05)。免疫荧光RT-PCR法测两组肺组织中的ADAMTS-7显示两组与空白组(规定其Folds值为1)比较均有统计学差异(P<0.05)；对照组与肺动脉高压组比较,两者具有统计学差异(P<0.05)。结论：ADAMTS-7可能参与肺动脉高压的发病过程。第二部分ADAMTS-7在肺动脉平滑肌细胞中的表达及可能作用机制研究目的：为明确ADAMTS-7在肺动脉平滑肌细胞中的表达及可能的作用机制。方法：培养人原代肺动脉平滑肌细胞,先用免疫荧光细胞化学进行了ADAMTS-7在肺动脉平滑肌细胞中的表达的检测；再用CCK-8法检测不同时间、浓度的TNF-α处理肺动脉平滑肌细胞,以明确其增殖的最佳时间及浓度。后进行分组,分为空白组、TNF-α25ug/L干预组、ADAMTS-7siRNA沉默组,分别培养12小时、24小时、48小时、72小时,再用RT-PCR法检测各组肺动脉平滑肌细胞中ADAMTS-7、PCNA、NF-κB、PI3K、VEGF、MARKK4、ERK1、IL-1、IL-6等因子的表达相对含量。取其中干预组24小时点用免疫蛋白印迹法(WesternBlot)检测ADAMTS-7、Bcl-2、COMP等因子的mRNA含量。结果：(1)通过细胞免疫荧光显示ADAMTS-7在肺动脉平滑肌细胞中丰富表达于平滑肌细胞胞浆内。(2)CCK-8法筛选出TNF-α在浓度为25μg/L,时间为24小时时对人肺动脉平滑肌细胞增殖的浓度时间为最优。(3)RT-PCR检测显示TNF-α25ug/L干预组ADAMTS-7、PI3K、PCNA、VEGF、IL-1、IL-6等因子的mRNA表达量在各个时间点均明显高于siRNA沉默组(P<0.05);ADAMTS-7在TNF-α干预后24小时其表达量最高,PI3K、PCNA、IL-1等因子的mRNA在TNF-α干预后48小时其表达量最高,VEGF、IL-6等因子的mRNA在TNF-α干预后72小时其表达量最高；另显示TNF-α25ug/L干预组NF-κB、MARKK4等因子的mRNA表达量除第12小时段无统计学意义外(P>0.05),其它各个时间段(24小时、48小时、72小时)表达明显高于siRNA组,两者差异具有统计学意义(P<0.05),其中NF-κB等因子的mRNA在TNF-α干预后24小时其表达量最高,MARKK4等因子的mRNA在TNF-α干预后48小时其表达量最高;ERK1因子的mRNA在两组各个时间点均无统计学差异(P<0.05)。(4)免疫印迹检测结果显示TNF-α干预组其ADAMTS-7表达量明显高于siRNA沉默组及对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),对照组表达量高于siRNA沉默组,差异具有统计学意义(P<0.05)；而COMP表达含量在siRNA沉默组及对照组明显高于TNF-α干预组,其差异具有统计学意义(P<0.05),siRNA沉默组及对照组相比较,二者无统计学差异(P>0.05)；在Bcl-2表达在三组相当,结果无统计学差异(P>0.05)。结论：(1)ADAMTS-7可能通过P13K、NF-κB、TNF-α、JNK等途径调节肺动脉平滑肌细胞的增殖或凋亡；(2)ADAMTS-7可能没有通过ERK、Bcl-2参与肺动脉平滑肌细胞的凋亡；(3)ADAMTS-7可能促进肺动脉平滑肌细胞COMP的降解及VEGF的表达。第三部分ADAMTS-7在野百合碱诱导肺动脉高压大鼠中的表达情况目的：通过干预野百碱诱导肺动脉高压大鼠,检测ADAMTS-7的表达情况及其对肺动脉平滑肌的增殖及炎症反应情况。方法：SD大鼠30只,随机分为正常对照组(对照组)、MCT诱导的肺动脉高压组(MCT组)、强力霉素组。21天后进行了平均肺动脉压力(mPAP)测定,右心肥大指数(RVHI)测定,并对大鼠肺组织进行ADAMTS-7免疫组织化学检测及TNF-α、NF-κB、IL-1、IL-6、PI3K、MARKK4等因子RT-PCR法检测,免疫印迹法检测各组ADAMTS-7、PCNA、Bcl-2的mRNA表达情况。结果：(1)MCT组及强力霉素组大鼠的mPAP和RVHI均高于对照组(P<0.05),强力霉素组mPAP比MCT组大鼠的mPAP低,但无统计学意义(P>0.05),其RVHI比MCT组RVHI低,并具有统计学意义(P<0.05)。(2)大鼠肺组织ADAMTS-7免疫组织化学显示MCT组明显高于对照组及强力霉素组(P<0.05),强力霉素组与对照组相比,前者高于后者,差值具有统计学差异(P<0.05)。(3)RT-PCR法测各因子mRNA示(规定对照组Folds值为1)TNF-α、NF-κB>、IL-1、IL-6、PI3K、MARKK4的mRNA表达在MCT组与强力霉素组均明显高于对照组,两者差异具有统计学意义(P<0.05)；各因子在MCT组明显高于强力霉素组,其差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)免疫印迹法结果显示：MCT组ADAMTS-7、PCNA、Bcl-2的mRNA表达高于对照组及强力霉素组,P<0.05；强力霉素组PCNA、Bcl-2的mRNA表达高于对照组,P<0.05；其ADAMTS-7的mRNA表达与对照组相当,无统计学意义,P>0.05。结论：强力霉素可能通过抑制ADAMTS-7来调节肺动脉平滑肌的增殖及炎症反应。单一强力霉素通过抑制ADAMTS-7等金属蛋白酶的作用机制来降低肺动脉压力效果不明显。
【作者】李波；
【导师】刘映峰；
【作者基本信息】南方医科大学，临床医学（专业学位），2014，博士
【关键词】金属蛋白酶；ADAMTS-7；肺动脉高压；平滑肌细胞；增殖；强力霉素；

【参考文献】
[1]高微微.大遗址周边区域空间形态的表征分析与研究[D].西北大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[2]白静,吴家骥,卢山,焦李成.基于提升Directionlet变换的零块嵌入图像编码算法[J].自动化学报,2011,03:283-289.
[3]杨奋为.航天电连接器材料的选用及质量控制[J].质量与可靠性.2002(01)
[4]徐蕤.端氨基有机硅改性双酚F环氧树脂的研究[D].合肥工业大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[5]王正仕,陈辉明.具有无功和谐波补偿功能的并网逆变器设计[J].电力系统自动化,2007,13:67-71.
[6]邓婷.中小学综合实践活动教师专业发展状况的调查研究[D].鲁东大学,教育管理（专业学位）,2014,硕士.
[7]田瑞博,王长松,李宝善,刘江.Opto22在锅炉控制系统中的策略优化[J].冶金自动化,2003,01:59-61.
[8]张勇.稀疏裂隙岩体三维饱和水流—传热及热应力半解析计算方法研究与应用[D].北京交通大学,2014.
[9]卢珊.纳米二氧化硅对小鼠胚胎发育影响的研究[D].哈尔滨工业大学,生物学,2013,硕士.
[10]游益云.基于生命周期供应链企业间信任影响因素与实证研究[D].江苏科技大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[11]李璐.对发展当代中国漆画艺术的几点思考[J].美术教育研究,2014,07:30-31.
[12]郭雯.试论巴赫《康塔塔》的艺术风格与演唱技巧[D].西安音乐学院,声乐演唱,2013,硕士.
[13]蔡菲菲.有机膨润土联合TiO_2光催化技术预处理垃圾渗滤液的研究[D].湖南大学,环境工程,2014,硕士.
[14]孟美丽.基于频率和温度的混凝土与沥青混合料介电模型研究[D].郑州大学,水工结构工程,2014,博士.
[15]谢葵英.培养幼师学生生物科学素养的研究与实践[D].广西师范大学,2005.
[16]段莉蕾.无铅钎料接头界面化合物层生长及元素扩散行为[D].大连理工大学,材料学,2004,硕士.
[17]张鑫.“越来越X”构式的研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[18]匡琼.论我国刑事案件合并审理制度[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[19]贾顺利.大直径袋装混凝土灌注桩在强盐渍土地区的应用研究[D].长安大学,结构工程,2014,硕士.
[20]王碧.液浮转子式微陀螺静电伺服技术研究[D].哈尔滨工业大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[21]李素珺.《中国达人秀》内容生产机制研究[D].华中科技大学,广播电视新闻学,2013,硕士.
[22]秦志洲.论我国突发环境事件应急管理法律体系的完善[D].山西财经大学,环境与资源保护法学,2013,硕士.
[23]张宝琳.数字助听器中声源定位及响度补偿算法的研究[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[24]周欢.商业化微电影与网络广告研究[D].湖南师范大学,设计艺术学,2014,硕士.
[25]王文斐,熊蓉,褚健.基于粒子滤波和点线相合的未知环境地图构建方法[J].自动化学报,2009,09:1185-1192.
[26]李伟伟,潘全香,姚路,陈改荣,席国喜.锂离子电池负极材料研究进展[J].电源技术,2013,07:1247-1249.
[27]李婧琳.高中古代散文阅读教学存在的问题及对策研究[D].鲁东大学,学科教学,2014,硕士.
[28]刘文丽.唐钢第一钢轧厂加热炉智能控制系统改造[J].冶金自动化,2011,04:71.
[29]王前辉,刘绍清,钱莎莎.基于数据挖掘的SP企业后继发展策略研究[J].广州大学学报(自然科学版),2005,04:337-340.
[30]杨平青.情感策略在外语课堂中的应用[D].福建师范大学,教育,2004,硕士.
[31]翁毅.码头改扩建工程项目可行性的研究与实践[D].浙江工业大学,2012.
[32]徐昌和.中美学校评价比较研究：组织、标准与实施[D].华东师范大学,比较教育学,2014,博士.
[33]崔颖.平安保险公司车险市场竞争战略研究[D].辽宁工程技术大学,企业管理,2004,硕士.
[34]李谦,景丽萍,于剑.基于多核学习的投影非负矩阵分解算法[J].计算机科学,2014,02:64-67.
[35]晏璎.大规模时、频域并行电磁算法研究[D].西安电子科技大学,电磁场与微波技术,2013,博士.
[36]沈青.TFT-LCD模组段供应链采购管理研究[D].厦门大学,物流工程,2014,硕士.
[37]郭萌.高校科研经费内部监管问题研究[D].北京交通大学,2014.
[38]文新宇.一类含输入时滞非线性系统的干扰观测器控制[J].自动化学报,2014,09:1882-1888.
[39]游玲君.基于铁路托盘共用系统的托盘调运优化研究[D].北京交通大学,2013.
[40]张迎宝.汉语中介语篇章信息结构研究述评[J].现代语文(语言研究版),2015,04:23-27.
[41]魏庆来,张化光,刘德荣,赵琰.基于自适应动态规划的一类带有时滞的离散时间非线性系统的最优控制策略(英文)[J].自动化学报,2010,01:121-129.
[42]王静.结构声学设计的可听化技术[D].西北工业大学,兵器发射理论与技术,2004,硕士.
[43]李峰.中国矿产资源储量分类与JORC类矿产资源储量分类的对比与研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2013,硕士.
[44]贺志贞.企业内部控制设计[D].对外经济贸易大学,会计学,2004,硕士.
[45]徐嫕珺.A公司物流考核指标研究[D].上海外国语大学,工商管理,2013,硕士.
[46]王伟.日本《金融商品交易法》信息披露制度研究[D].厦门大学,法律,2014,硕士.
[47]钟丽波.含风电并网的二级电压控制分区方法研究[D].东北电力大学,电气工程,2013,硕士.
[48]张黎.湿法冶金铜萃过程铜组分含量预测方法的研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2009,硕士.
[49]冯新豹.基于.NET的学生资助管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[50]张晓玲,张志达.推钢机伺服控制系统[J].冶金自动化,1998,04:49-50.