荔波连蕊茶GA20-氧化酶和GA2-氧化酶基因调控株型的功能研究

【摘要】GA20-氧化酶和GA2-氧化酶是赤霉素合成代谢途径中的两个关键酶，都由多基因家族编码，参与调控植物内源活性GA水平。目前模式植物中GA20-氧化酶和GA2-氧化酶的功能研究较多，但在山茶属植物中GA20-氧化酶和GA2-氧化酶基因的功能及调控株型等研究还未见报道。本研究采用同源克隆方法从荔波连蕊茶(CamellialipoensisChangetXu)中分离出5个与赤霉素合成代谢相关基因的cDNA全长：GA20-氧化酶基因2个和GA2-氧化酶基因3个，分别命名为ClGA20ox1、ClGA20ox2、ClGA2ox1、ClGA2ox2和ClGA2ox3。采用生物信息学软件分析基因序列，表明这些基因是所克隆的目的基因。实验获得的GA20-氧化酶和GA2-氧化酶基因在大肠杆菌E.ColiBL21中经IPTG诱导能表达出相应的蛋白，表明克隆的GA20-氧化酶和GA2-氧化酶基因具有在真核生物中编码蛋白质的能力。荧光定量PCR分析GA20-氧化酶和GA2-氧化酶在在荔波连蕊茶不同器官及发育的不同时期的表达模式。ClGA20ox1和ClGA20ox2基因在当年抽生的幼嫩茎中的表达量均较低，在茎和根中的表达量均较高。其中ClGA20ox1基因在种子的表达量最高，在嫩叶中的表达量最低。ClGA20ox2基因在茎中的表达量最高，在当年新抽生的幼嫩茎尖表达量最低。表明ClGA20ox1基因可能主要参与植物种子和根的生长发育调控，ClGA20ox2基因可能主要参与植物茎和叶的生长发育调控。ClGA2ox1、ClGA2ox2和ClGA2ox3基因在成熟叶片中都有较高表达，在种子和嫩叶中的表达量都较低。其中ClGA2ox1基因在茎中的表达量最高，在嫩叶中的表达量最低。ClGA2ox2基因在荔波连蕊茶的成熟叶片中表达量最高，在种子中的表达量最低。ClGA2ox3基因在根中的表达量最高，在嫩叶中的表达量最低。表明ClGA2ox1基因可能主要参与植物茎和叶的生长发育；ClGA2ox2基因可能主要参与植物煮熟叶片的衰老代谢；ClGA2ox3基因可能主要参与根的生长发育。利用pCAMBIA1300表达载体分别构建了ClGA20ox1、ClGA20ox2、ClGA2ox1、ClGA2ox2和ClGA2ox3基因的正义表达载体，转化烟草，共获得转基因植株130株。从每个基因的阳性植株中随机挑选5个株系，经PCR、RT-PCR和Southernblotting鉴定出阳性株系3株。实时荧光定量PCR分析表明，在烟草对照植株中没有检测到目标基因表达，而在转基因植株中目标基因的表达量均显著提高，其中ClGA20ox1基因在转基因植株中最高表达量是149；ClGA20ox2基因的表达量达到144；ClGA2ox1基因的表达量达到217；ClGA2ox2基因的表达量达到71；ClGA2ox3基因的表达量达到258。同一基因在不同转基因株系中的表达量亦各不相同，随着ClGA20ox1和ClGA20ox2基因的表达量提高，转基因烟草植株节间伸长和株高增加等表型更加明显；随着ClGA2ox1和ClGA2ox3基因的表达量提高，转基因烟草植株矮化程度加剧。植株内源GA4含量测定结果显示转ClGA20ox1和ClGA20ox2基因的烟草植株叶片中GA4含量显著提高，而茎中GA4含量没有显著变化。转ClGA2ox1、ClGA2ox2和ClGA2ox3基因烟草植株叶片中GA4含量显著降低，其中转ClGA2ox3基因烟草植株降低最多。烟草对照植株经多效唑处理后，叶片中GA4含量显著下降，而茎中GA4含量无显著变化。这表明叶片中活性赤霉素的含量与植株的株型调控密切相关，ClGA20ox1和ClGA20ox2基因在转基因植株中过量表达，引起叶片中活性GA含量上升，从而促使植株伸长生长；ClGA2ox1和ClGA2ox3基因的过量表达，导致叶片中活性GA降低，从而诱导植株矮化；茎中的活性赤霉素水平对株型调控影响小。ClGA20ox1、ClGA20ox2基因促进植株叶肉细胞伸长，株高增加，节间伸长，始花期提前。转ClGA2ox1、ClGA2ox3基因抑制叶肉细胞伸长生长，叶片缩小，节间缩短，抑制花芽分化。另外，转ClGA2ox1、ClGA2ox2、ClGA2ox3和ClGA20ox2基因的烟草植株结实数量均少于对照烟草。转ClGA20ox1基因的烟草结实量与对照植株差异不显著。转ClGA2ox1基因烟草平均单果质量约为对照的一半，而转ClGA2ox3基因的烟草平均单果质量为对照的1.3倍；转ClGA2ox2、ClGA20ox1和ClGA20ox2基因的烟草植株平均单果质量与对照差异不显著。本研究从荔波连蕊茶叶片中分离出的ClGA2ox1基因不仅抑制植株伸长生长，而且抑制花瓣生长，能正常开花结实，这在花卉分子育种上具有重要的应用价值。ClGA2ox3基因不仅抑制植株伸长生长，而且平均单果质量显著提高，植株能正常开花结实，这对园艺植物分子育种具有重要的应用价值。ClGA20ox1和ClGA20ox2能显著促进植株增高，为将来利用RNA干扰或反义RNA等分子技术培育矮化植株奠定基础。
【作者】肖政；
【导师】李纪元；
【作者基本信息】中国林业科学研究院，园林植物与观赏园艺，2014，博士
【关键词】荔波连蕊茶；基因克隆；GA20-氧化酶；GA2-氧化酶；叶绿素；

【参考文献】
[1]房明.墙板-钢框架协同体系拟静力试验及有限元分析[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[2]苏蒙.健脾补肾法从抗氧化及抗炎途径治疗轻度认知功能障碍的研究[D].浙江中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[3]代羽.CRN中基于超时隙的集中式信道分配策略及性能研究[D].燕山大学,计算机技术,2013,硕士.
[4]潘晓.金代浑源刘氏家族文学研究[D].山西师范大学,中国古代文学,2014,硕士.
[5]黄涵年.农药氟虫腈作用下斑马鱼microRNA-155对cyb561d2的调控作用研究[D].浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[6]任斌全.网络环境下企业技术创新组织问题研究[D].西安理工大学,技术经济及管理,2004,硕士.
[7]吴静霞.项目进度管理在天津赛宝科技公司安全审核与绩效管理系统开发中的应用[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[8]李淼.《史记》中时量成分的入句研究[D].华中师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[9]刘雪峰.Bi_2O_3掺杂YSZ系固体电解质材料制备与性能研究[D].山东大学,材料学,2013,硕士.
[10]朱建军,刘思峰,王翯华.群决策中两类三端点区间数判断矩阵的集结方法[J].自动化学报,2007,03:297-301.
[11]雷竹峰.卧式深孔珩磨机的结构设计与优化[D].中北大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[12]杨晶东.大连红十字血液中心管理信息系统设计与实现[D].大连理工大学,计算机科学与工程,2003,硕士.
[13]徐伟峰.农信社信贷分析管理系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[14]姜文杰.螺杆菌与原发性肝癌相关性研究[D].青岛大学,传染病学,2003,硕士.
[15]卞革.关于n维单形若干几何不等式的稳定性[D].安徽大学,基础数学,2014,硕士.
[16]尤煦.中国法律援助若干问题研究[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[17]梁长秀.家庭医生服务责任制下社区糖尿病互动式管理模式探索[D].苏州大学,临床医学,2013,硕士.
[18]温宁.牙科CAD/CAM用玻璃渗透氧化铝陶瓷的色度学研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2004.
[19]陈露.英语硬新闻汉译实践研究总结[D].华中师范大学,翻译,2013,硕士.
[20]孙双谦.财富、储蓄、税收政策与企业家精神[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[21]张学敏.寇準与真宗朝政治研究[D].东北师范大学,中国古代史,2012,硕士.
[22]聂华丽,张元明,吴楠,张静,张丙昌.生物结皮对5种不同形态的荒漠植物种子萌发的影响[J].植物生态学报,2009,01:161-170.
[23]鲍军鹏,李鹏,刘晓东,沈钧毅.用数据挖掘方法扩充知识库的研究及应用[J].小型微型计算机系统,2004,04:621-624.
[24]张勇刚.企业信息化测度理论与方法研究[D].重庆大学,2004.
[25]陈喜财.冀北东坪金矿成矿规律与找矿方向研究[D].石家庄经济学院,矿物学、岩石学、矿床学,2014,硕士.
[26]韩玉乾.伊恩·麦克尤恩小说《星期六》中的凝视、反抗和移情[D].华中师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[27]钟美霞.不同采样频率时间序列的多步预测比较研究[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[28]李志强.粗集理论及其在网络故障诊断中的应用研究[D].河北工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[29]刘丹.我国劳动力市场现状对企业薪酬规划的影响[D].辽宁师范大学,应用数学,2012,硕士.
[30]马瑶.多尺度几何分析遥感图像融合及分类方法研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[31]李卢玲,张用夏,周伏洪.柴达木盆地航磁直接找气的地质效果[J].石油地球物理勘探,1987,02:163-168+216.
[32]陈东辉,翟秋阁.聚谷氨酸/多壁碳纳米管修饰玻碳电极测定扑热息痛[J].信阳师范学院学报(自然科学版),2014,02:243-246.
[33]易娜.江西省新型农村社会养老保险经办管理服务研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[34]宫媛.大城市生态绿地空间的保护与营造[D].天津大学,城市规划与设计,2004,硕士.
[35]张晓冬.用数据仓库来实现决策支持[J].信息技术,2005,07:118-120.
[36]范慧.可逆燃料电池—电解池氧电极复合改性研究[D].中国矿业大学（北京）,应用化学,2014,博士.
[37]向绪芳.某路桥隧道公司“学习型组织”构建研究[D].电子科技大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[38]程琳.我国零售业精益成本管理问题探析[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[39]谭骏祺.《IBM公司2012年度报告》（节选）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[40]周平.城市地理信息系统中若干问题研究[D].大连理工大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[41]尹哲.图书馆经济管理的理论模式与框架[D].湘潭大学,图书馆学,2003,硕士.
[42]蒋忠中,汪定伟.B2C电子商务中配送中心选址优化的模型与算法[J].控制与决策,2005,10:1125-1128+1136.
[43]张洁磊.惩罚性赔偿的程序机理[D].烟台大学,法律,2014,硕士.
[44]曹宝亮.耦合腔中双原子的量子关联[D].大连理工大学,理论物理,2013,硕士.
[45]卢林.新社会组织党建问题研究[D].吉林大学,公共管理,2013,硕士.
[46]曹宁.基于双DSP的SINS/GPS车载组合导航系统的设计与软件实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2008,硕士.
[47]肖恬.绩效管理在湖南省民办高校体育教师管理应用中的思考与分析[D].湖南师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[48]严洪森,刘飞.知识化制造系统——新一代先进制造系统[J].计算机集成制造系统-CIMS,2001,08:7-11.
[49]小溪.数据仓库[J].国土资源信息化,2004,03:48.
[50]王宏图.立宪与革命两派的国民程度论及其政体选择[D].河北师范大学,中国近现代史,2012,硕士.