猪巨细胞病毒快速检测方法的建立及河南猪群流行病学调查

【摘要】猪巨细胞病毒病是由致猪发病的猪巨细胞病毒(PorcineCytomegalovirus,PCMV)引起的种条件性传染病。长期以来由于对该病研究不够深入,其对猪群的危害性没有得到足够关注。但近年来研究发现该病毒主要在猪肺泡巨噬细胞中增殖破坏机体免疫系统,造成机体感染后抵抗力降低,易并发和继发其他病原体(如猪蓝耳病)感染,PCMV对养猪业的危害逐渐引起了行业人士的高度重视。因此,开展该病的快速诊断方法研究和流行病学调查,对降低该病对养猪业的危害具有重要意义。本研究应用基因工程技术对PCMV的DNA聚合酶基因特异性片段进行克隆和序列测定；大量比对GenBank中PCMVDNA聚合酶基因序列,设计PCR和荧光定量PCR(FQ-PCR)特异性引物和TaqMan荧光探针,优化反应条件,建立PCMVPCR和FQ-PCR检测方法并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,对疑似PCMV感染的临床样品采采用FQ-PCR方法进行应用检测,同时与常规PCR方法进行对比实验,对检测结果为PCMV阳性猪的不同组织器官和血清进行病毒含量测定；对2009年～2011年河南省部分猪群进行了PCMV感染和混合感染的流行病学调查。结果显示：成功对PCMV的DNA聚合酶基因进行了克隆和序列测定,该基因与GenBank中登录的PCMVDNA聚合酶基因的核苷酸同源性达99.3%；成功建立了PCMVPCR方法和FQ-PCR方法,建立的PCR方法特异性强,敏感性高,重复性好,最低检出量为100拷贝/μL。建立的FQ-PCR方法的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0,998；FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1拷贝/μL,是常规PCR的100倍；特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应；对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好；对15份临床疑似PCMV感染的组织样品的FQ-PCR应用检测,结果有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。感染PCMV的猪组织器官和血清中均有病毒存在,含量最高的是扁桃体,最低的是小肠。对2009年～2011年河南省部分猪群进行PCMV感染状况的流行病学调查结果显示：PCMV的感染呈逐年增加趋势,其中2011年猪群的阳性率最高(58.7%),2010年次之(52.6%),2009年猪群的阳性率较低(44.3%)。对不同饲养模式的猪群进行PCMV感染状况进行流行病学调查显示,PCMV在不同的饲养环境中都有感染,其中散养户猪阳性率最高(60.5%),小规模场次之(50.6%),大规模场最低(33.3%)；对不同年龄的猪群进行PCMV感染状况的流行病学调查显示,PCMV在猪群中感染普遍,其中仔猪阳性率最高(65.2%),母猪次之(47.9%),育肥猪最低(37.9%)；对PCMV与其他病原的混合感染状况进行流行病学调查结果显示：PCMV与猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒存在二重或三重混合感染现象。本研究成功建立了PCMV的PCR方法和FQ-PCR方法,用FQ-PCR方法对猪的组织器官和血清中PCMV含量进行了定量检测,对2009年～2011年河南省部分猪群PCMV感染和与其他疫病混合感染状况进行了流行病学调查。该研究结果丰富了我国PCMV流行病学调查内容,加深了对我国PCMV感染现状的了解,对我国PCMV的科学防控将具有重要的指导意义。
【作者】拜廷阳；
【导师】赵德明；吴志明；
【作者基本信息】中国农业大学，预防兽医，2014，博士
【关键词】猪巨细胞病毒；克隆测序；PCR；实时荧光定量PCR；流行病学调查；

【参考文献】
[1]杨晓奇.供应链管理的实施及其评价[D].北方工业大学,数量经济学,2004,硕士.
[2]李荣生,高弋绢.论水利工程建设与耕地总量平衡[J].水利规划设计.2001(04)
[3]靳智勇.非小细胞肺癌基因多态性在患者疗效预测及预后判断中的研究[D].北京市结核病胸部肿瘤研究所,免疫学,2014,博士.
[4]李鑫.什么是正义？《理想国》第一卷解析[D].华东师范大学,外国哲学,2013,硕士.
[5]刘建民.大连金州新区城市社区居家养老中的政府责任问题研究[D].大连理工大学,MPA（专业学位）,2013,硕士.
[6]段其昌,张红雷.基于搜索空间可调的自适应粒子群优化算法与仿真[J].控制与决策,2008,10:1192-1195.
[7]魏琼琼.基于TTCN-3的HIMAC协议一致性测试软件设计[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2011,硕士.
[8]宋刘虎.时域有限元中几个关键问题研究[D].西安电子科技大学,无线电物理,2012,硕士.
[9]王筱琪.通讯网络管理系统过程管理[D].复旦大学,项目管理,2012,硕士.
[10]后永春.农村地区结核病发病率及其影响因素研究[D].华中科技大学,流行病与卫生统计学,2013,硕士.
[11]牛灿杰,陈小珍,张慧,王展华,马千里,徐生坚.凝胶色谱分离-柱后染色法快速鉴别橙汁掺假[J].食品与发酵工业,2015,01:230-233.
[12]伍涛.双流县区域医疗健康档案平台研究与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[13]张洪岩励惠国.数字地球时代的地理信息科学[N].中国测绘报,2002-01-01003.
[14]顾海燕.关系贷款作为中小企业融资途径的激励可行性分析[D].清华大学,数量经济学,2003,硕士.
[15]赵国璧.基于.Net的工商案件管理信息系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[16]陈靖雅.刑事司法视野下的恐吓行为[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[17]李少亮.粘弹性复合圆柱壳结构在冲击载荷作用下的动力学响应与结构抗冲击设计[D].哈尔滨工业大学,固体力学,2013,硕士.
[18]李凌.碳纤维复合材料数字化超声检测系统关键技术研究[D].浙江大学,2007.
[19]温国军.慢性乙型病毒性肝炎肝郁脾虚和脾胃湿热证转录组学研究[D].成都中医药大学,中西医结合临床,2012,硕士.
[20]谭晶荣,童晓乐.中国与金砖国家贸易关系持续时间研究[J].国际贸易问题,2014,04:90-100.
[21]党杰,李勇,徐友平,黄涌,曾正,董明齐.基于WAMS和奇异熵矩阵束方法的电网低频振荡仿真分析[J].电力系统自动化,2010,15:14-18.
[22]徐李刚.C/C复合材料与Nb钎焊工艺及机理研究[D].哈尔滨工业大学,材料工程,2013,硕士.
[23]董学平,温锐,刘红亮.一类时滞分布参数切换系统的鲁棒容错控制[J].控制与决策,2012,02:232-236.
[24]方轩正.西宁地区扩张型心肌病患者室性心律失常与心率变异性的关系[D].青海大学,内科学,2014,硕士.
[25]周天驰.资产评估现金流预测模型研究[D].首都经济贸易大学,资产评估（专业学位）,2013,硕士.
[26]李小姗.碳负载锡钴合金锂电负极材料的制备与表征[D].陕西师范大学,2014.
[27]马廷淮,张海盛,曾振柄.带结论域的关联规则的挖掘[J].计算机工程,2003,05:16-17+66.
[28]蔡万山.中小企业信贷融资模式分析[D].广东财经大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[29]王文龙.动态目标防御中的诱骗与反攻击方法研究[D].华中科技大学,控制工程,2013,硕士.
[30]谢梅娣.针织物导湿性能研究[D].东华大学,纺织工程,2004,硕士.
[31]刘九庆.植物根系图像监测分析系统[D].东北林业大学,2005.
[32]李晓,邱玉辉.基于MAS的Web用户数据预处理[J].广西师范大学学报(自然科学版),2003,01:160-163.
[33]韩爱民,肖军华,梅国雄.被动桩中土拱效应特征与影响参数研究[J].工程地质学报,2006,01:111-116.
[34]李思佳.河北秦皇岛市妇女小额贷款问题研究[D].云南财经大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[35]宋建洋.本底站辐射数据质量评估与特征分析[D].中国气象科学研究院,气象学,2013,硕士.
[36]宋钰元.我国上市公司碳信息披露质量影响因素实证研究[D].兰州理工大学,会计学,2014,硕士.
[37]马博.高温、CO_2加富对温室嫁接黄瓜Rubisco羧化酶活性、净光合速率和果实品质的影响[D].内蒙古农业大学,蔬菜学,2013,硕士.
[38]夏晓昀.苏南地区廉租住房政策研究[D].南京农业大学,社会保障,2011,硕士.
[39]张敏.数字化图书馆的发展与文献信息服务创新[J].陕西教育学院学报,2003,03:111-113.
[40]廖江军.珠三角农产品冷链物流配送交易中心项目策划书[D].华南理工大学,高级管理人员工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[41]谢宗强,陈伟烈.濒危植物银杉的群落特征及其演替趋势[J].植物生态学报,1999,01:49-56.
[42]姚行之.从出入境管理看中国双重国籍处理制度[D].宁波大学,国际法（专业学位）,2014,硕士.
[43]林秀华.原生建筑理论探究[D].中央美术学院,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[44]许杰.我国乡镇政府绩效评估中公众参与问题研究[D].大连海事大学,公共管理,2014,硕士.
[45]陈彩姣.中原经济区建设背景下新市民继续社会化问题研究[D].郑州大学,社会学,2013,硕士.
[46]彭婧婕.《论语》英译的主体间性研究[D].浙江工商大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[47]薛禹群.中国地下水数值模拟的现状与展望[J].高校地质学报,2010,01:1-6.
[48]王浩.教育信息化发展技术路线图研究[D].长安大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[49]郑碧.论国家科技计划项目的知识产权权属制度[D].华东政法大学,知识产权,2012,硕士.
[50]刘星宇.基于感知的三维视频编码技术研究[D].宁波大学,信号与信息处理,2014,硕士.