HLA在肾脏移植配型中的应用研究

【摘要】人类白细胞抗原(HLA)是人体主要组织相容性基因(MHC),介导实体器官移植中的超急性、加速性、急性和慢性排斥反应,是器官移植免疫反应中的首要角色。HLA配型的应用使得肾移植后超急性和加速性严重排斥反应罕见发生,急性排斥已经成为影响肾移植后人／肾近期和远期生存率的最重要因素。2001年美国联邦立法将HLA配型列入器官移植技术标准,2006年中国卫生部将HLA配型列入器官移植管理法规。肾移植进行供受者HLA配型的必要性无容置疑,其目的就是测定供体与受体HLA相容性程度,力求使排斥反应减小到最低程度。同时,移植受者由于接触过同种HLA抗原而产生的抗-HLA抗体,必须通过PRA检测来反映受者体内抗-HLA抗体体液免疫状态,从而准确预测肾移植后超急性和加速等严重排斥反应的发生和排斥反应的强度,有效改善肾移植近期效果和远期效果。而目前国内外公认肾脏移植配型许可的标准为：供受者淋巴毒交叉配型阴性、通过PRA检测确认受者不存在不可接受的供者HLA基因、进行供肾与受者HLA相合(MM)程度的评估。其中,供受者淋巴细胞毒交叉配型为阳性或受者存在针对供者HLA的特异性抗体时,被视为肾脏移植的禁忌指标,但是供受者HLA相合程度的未见具体的标准。尽管近年来对MICA、KIR、调节性T细胞(Treg)等与肾移植的相关研究十分热烈,但都远远不足于动摇HLA在获得最佳肾移植效果中无可替代的地位。主要体现在如下几方面：1.HLA作为人体免疫系统的核心,是人类的免疫应答基因,同时也是遗传标记物,研究证实某些HLA基因与终末期肾脏病(ESRD)的存在易感关联,这种易感关联具有种族和地域差异。同时,ESRD患者的家族聚集性,也提示了存在相关的易感基因的可能。研究两者间的易感关联,有助于阐明ESRD的发病机制,而且HLA作为一种疾病发生的遗传标志可用于ESRD的易感预测、鉴别诊断、病因分类、治疗及预后分析。2.HLA生物学功能体现在抗原识别、处理和递呈、约束免疫细胞之间的相互作用、参与T细胞活化通路的多个环节、特异性免疫调节、免疫应答(激活、抑制),将外来抗原(供者)提呈给相应T细胞受体,从而激发免疫细胞克隆、增殖和分化,导致移植排斥反应的发生最终导致移植物失功。研究发现,供受者HLA相合程度越高,则肾移植受者术后出现PRA阳性机会越低、移植物排斥反应几率越少、移植物有功能存活时间越长、移植后所需排斥药物的血药浓度水平越低。因而HLA相合率已经成为临床医师决定移植供受者的重要因素。3.移植受体内存在HLA抗体(PRA)对临床肾移植有重要的影响。PRA作为一种IgG类型的体液免疫性抗体,能特异性地针对供者的HLA抗原,这种HLA抗体能够直接杀伤移植肾细胞,是引起超急性排斥、加速性排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应和最终导致移植物失功的元凶。但是,HLA与ESRD的发生、发展的相关性以及在肾移植中应用中仍存在许多问题有待解决。例如：(1)HLA与ESRD的易感关联,确切机制至今未明；HLA本身在肾移植中的作用,包括HLA与移植物失功的易感关联有待进一步研究。(2)已知HLA相合率对移植物长期生存有决定性的作用,而HLA相合率对移植近期效果的影响的研究较少。另外,供肾的匮乏与追求供肾的HLA高度相合之间存在矛盾,如何在两者间取得平衡,使得在尽量缩短受者移植轮候时间的同时,获得理想的HLA相合分数的移植有待研究。(3)PRA阳性受者存在不可接受的HLA基因必然导致其获得移植机会减少,等待时间相应增加,为使临床医师预先了解致敏受者与任何供者交叉配型阳性的可能性、为选择移植肾来源提供数据支持,建立一种能反映PRA阳性患者与供者不相容的的真实几率的校正PRA(CPRA)方法的需求,显得非常迫切。第一章中国南方ESRD患者HLA易感关联研究目的(1)对中国南方ESRD患者中HLA的表达进行分析,探讨HLA与ESRD的易感风险。(2)对肾移植术后5年内移植肾失功与HLA多态性进行相关性研究,探讨HLA在移植肾失功中的临床应用价值。材料与方法(1)收集2000年1月-2013年6月在南方医科大学南方医院、中国人民解放军第458医院等16家移植中心登记等候肾脏移植的ESRD患者,年龄、性别不限。通过病历复习选择HLA基因分型资料完整的ESRD患者4670例。健康对照组为2686例南方汉族对照来自广州市中心血站和深圳市中心血站的健康献血者。(2)采集2000年1月～2009年2月肾移植手术病例且持续随访5年以上的受者896例(年龄、性别不限、HLA基因分型资料完整),其中术后移植肾5年内失功即血肌酐升至707μmol/L以上行透析治疗的的受者50例,列为移植肾失功组；术后5年肾功能仍然正常,血肌酐<150μmol/L的受者701例,列为对照组。留取EDTA抗凝血3ml,采用PCR-SSP分型方法进行HLA-A、B、DR基因分型。HLA基因的表现型频率PF=n/N,基因频率GF=1-(1-n/N)1/2,采用卡方检验对病例组与对照组的HLA-A、B、DRB1基因频率逐一进行关联分析(当某一位点表现为两个相同的基因,即纯合子时,计作一个)。必要时采用Yates检验方法与Fisher确切概率法计算确切P值。多重比较采用Bonferroni方法校正检验水准α值,Pc值≤0.05具有统计学意义,同时按Woolf公式计算相对危险度(RR)的比值比(OR)及95%的可信区间(CI),均数比较用两样本t检验,率的比较用卡方检验,均为双侧检验,检验水准a=0.05。结果4670例ESRD患者中,男性3068人,女性1602人,男：女=2.04：1,平均年龄(43.74±13.50)岁。原发病按比例由多到少依次为：慢性肾小球肾炎尿毒症76.08%>糖尿肾病5.96%>其他原因5.91%>病因不详5.01%>多囊肾并尿毒症3.13%>高血压肾病2.16%>双肾多发性结石1.24%>红斑狼疮性肾病0.54%。比较HLA基因在ESRD组和健康对照组间的分布,经Pc校正之后两组间HLA-A1、A3、A11、A24、A30、A31、A32、B7、B8、B38、B44、B46、B52、B56、B57、B60、B61、B62、B67、B71、B75、DR1、DR4、DR7、DR8、DR12、DR13、DR14和DR16频率的差异有统计学意义(Pc<0.05)。0<OR<1的有HLA-A1、A3、A30、A31、A32、B7、B8、B44,B52、B57、B61、B62、B67、B71、DR1、DR7和DR13,OR>1的有A11、A24、B38、B46、B56、B60、B75、DR4、DR12和DR14。比较移植肾失功组与对照组HLA多态性分布的差异,失功组HLA-DR17的频率显著高于对照组(PF=0.372VS0.120,Pc=0.00,OR=4.50)。结论研究显示,HLA-A11、A24、B38、B46、B56、B60、B75、DR4、DR12和DR14基因可能为中国南方汉族ESRD的易感基因；HLA-A1、A3、A30、A31、A32、HLA-B7、B8、B44、B52、B57、B61、B62、B67、B71、DR1、DR7和DR13基因可能为中国南方汉族ESRD的抵抗基因；HLA-DR17本身可能就是导致移植肾5年内失功的高危因素。HLA多态性可能是导致移植效果差异的原因之一,但是HLA的表达及其多态性在因各类肾脏疾病导致最终并发ESRD进程中的免疫遗传易感性及相关危险性作用机制,仍未明确,有待进一步研究。第二章肾移植供受者HLA相合分析及其对肾移植效果的影响目的对肾移植供受者HLA相合分数进行分析,探讨供受者HLA-A、B、DR&DQ相合率对肾移植后3年效果的影响。材料与方法收集2006年1月～2011年12月期间在南方医科大学南方医院和中国人民解放军第四五八医院完成初次尸体肾移植的受者资料428例,受者需符合供受者HLA基因分型资料完整、受者术前PRA阴性、术后持续随访>37个月。采集术后发生急性排斥(AR)以及3年内受者有功能生存的情况。参照美国器官共享联合网络(UNOS)的策略,计算供受者间HLA-A、B、DR&DQ四个座位的相合率,同一座位的基因有1个相同记为1分,2个基因相同记为2分,无相同基因记为0分,四个座位分数相加即为HLA相合率。按照供受者HLA相合率分数,即0、1、2、3、4、5、6、7、8分,共分为9组,并以供受者HLA相合率0～8分为节点,分为0-8分组合组。对供受者之间HLA、B、DR&DQ的相合分数进行,并分析HLA相合分数与移植后3年内移植肾AR、受者有功能生存的相关性。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,组间均数比较用两样本t检验,率的比较用卡方检验,必要时采用Yates检验方法与Fisher确切概率法计算确切P值,均为双侧检验,检验水准α=0.05。结果428例接受初次肾移植受者的平均年龄为(41.81±11.32)岁,HLA-A、B、DR、DQ的4个位点8个基因相合分数的平均值为(3.01±1.48)分,其中HLA-A、B、DR,DQ位点相合分数的平均值分别(0.87±0.63)分、(0.59±0.58)分、(0.69±0.62)分和(0.85±-0.06)分,相合分数由高到低依次为A位点>DQ位点>DR位点>B位点。HLA-A、B、DR、DQ单个位点的相合分数为0分的比例,由高到低的顺序依次为B位点>DR位点>A位点>DQ位点,1分相合的百分比为DQ位点>A位点>DR位点>B位点,2分相合的百分比为A位点>DQ位>DR位点>B位点。HLA相合率0-8分组中比例最多的是3分组,占总对数的28.7%,其次是2分组和4分组,占23.1%和18.2%,相合数为8分仅为2对,占0.5%,HLA相合率的分布呈2-4分组较多,0分及7-8分少的趋势。428例肾移植受者术后AR率为17.76%,HLA相合分数0～8分组中AR率最高为0分组(33.33%),AR率从高到低排列依次为0分>2分>1分>7分>3分>6分>5分>4分>8分,分别0-9分组间的AR率的差异进行比较,其中HLA相合2分组与4分组之间AR率的差异存在统计学意义(P=0.03),其余组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。以供受者HLA相合分数0-8分为节点划分为8对0-8分的组合组,其中相合分数<3分的组合组的AR率均>30%,其中0-1分组合组AR率最高,为34.04%；相合分数1>3分的组合组,AR率均<10%。分别对8对组合组之间的AR率进行比较,0-1分组合组与2-8分组合组、0-2分组合组与3-8分组合组、0-3分组合组与4-8分组合组、0～4分组合组与5～8分组合组、0-5分组合组与6-8分组合组、0-6分组合组与7-8分组合组以及0-7分组合组与8分组之间AR率的差异均具有统计学意义(P<0.05),并以HLA相合率0～2分与3-8分组合组之间差异性最大(x2=26.40)；0分组与1-8分组合组之间AR率的差异无统计学意义(P>0.05)。428例肾移植受者移植1年人/肾存活率为95.33%,2年人/肾存活率为92.76%,3年人/肾存活率为91.12%。0-8分组按1年人/肾存活率从高到低排列,依次为HLA相合率8分=7分=6分>4分>1分>3分>5分>2分>0分组,3年人/肾存活率从高到低排列依次为8分=7分>4分>6分>5分>3分>1分>2分>0分组。结论由于HLA存在的高度多态性,导致供受者之间肾移植受者获得HLA-A、B、DR&DQ全相合供者的几率极低。本研究真实地反应了由移植医师选择肾移植供受者的HLA相合分数为(3.01±1.48)分。研究证实,HLA相合率对初次移植肾的近期效果具有显著影响,供受者间HLA相合率越高,术后发生排异反应等几率越低,尤其当HLA相合分数≥3分时,移植后AR率降低明显。研究提示,为了获得良好的肾移植近期效果,同时提高移植肾的长期存活率,初次肾移植受者应尽量选择供受者HLA相合率≥3分的供者,尽量避免选择供受者相合分数0-1分的供者。第三章采用校正PRA方法分析HLA抗体阳性受者获得肾脏移植的几率目的建立一种分析PRA阳性患者与供者不相容几率的校正PRA(CPRA)方法,采用校正PRA(CPRA)方法分析临床肾移植中受者获得移植物的几率。方法收集2000年1月～2012年12月间在南方医科大学南方医院及中国人民解放军第四五八医院进行移植、且HLA基因分型资料完整供者共2004例；收集2008年1月～2012年12月间在南方医科大学南方医院及中国人民解放军第四五八医院等候肾移植的PRA阳性(PRA强度为峰值)的受者202例。采用PCR-SSP方法对2004例供者进行HLA-A、B、DR分型并建立供者HLA数据库,应用Arlequin软件3.11计算单个HLA-A、B、DR基因以及A-B、A-DR、B-DR和A-B-DR单倍型出现的频率,以此为基础建立了CPRA-Java计算软件,将PRA特异性结果作为不同接受的HLA基因,并在CPRA计算软件中输入各种基因组合时,即可获得一个CPRA的百分数,以代表不可接受HLA基因在该供者群体中所占的期望值百分比。采用ELISA方法对202例PRA阳性受者的血清进行HLA抗体确定实验,分析PRA强度(%)和HLA抗体特异性,将202例PRA特异性抗体作为不可接受的HLA基因,计算相应的CPRA值。按照PRA致敏程度,分别比较低度致敏(PRA>0-10%)、中度致敏(PRA>10～30%)和高度致敏(PRA>30%)与该致敏程度CPRA的平均强度的差异；比较PRA低、中、高致敏组中CPRA值(>0-10%、>10-30%和>30%)的分布情况,对PRA强度和CPRA值的均值进行一致性比较。CPRA值与PRA强度均值的比较采用独立样本t检验。CPRA值与PRA强度一致率的计算使用kappa参数。数据处理采用SPSS13.0软件,均为双侧检验,检验水准α=0.05。结果分析2004例供者的HLA-A、B、DR表达情况,将202例PRA阳性受者的HLA抗体特异性结果,输入CPRA-Java软件,获得含全部不可接受基因的供者期望值频数,即获得相应的CPRA值。202例PRA阳性受者平均强度为(23.12±17.96)%,CPRA均值为(46.07±23.30)%。低度致敏者(PRA>0-10%)占受者的30.69%(62/202),PRA平均强度为(6.87%±2.41)%,组中CPRA均值为(21.63±11.75)%,PRA平均强度与CPRA均值之间存在显著的统计学差异(P<0.05)；中度致敏者(10-30%)占受者的45.049%(91/202),平均强度为(20.15±5.17)%,组中CPRA均值为(50.56±16.86)%,PRA平均强度与CPRA均值之间存在显著的统计学差异(P<0.05)；高度致敏者(>30%)占受者的24.26%,平均强度为(49.20±15.17)%,组中CPRA均值为(68.64±15.35)%,PRA平均强度与CPRA均值之间无显著的统计学差异(P>0.05)。分别比较三种致敏程度中CPRA均值的差异,其中低度致敏组与中、高度致敏组的差异均存在统计学差异(P<0.05),中度致敏组和高度致敏组之间CPRA均值的差异则不存在统计学差异(P>0.05)。分析PRA低、中、高致敏组中CPRA值(>0-10%、>10～30%和>30%)分布的差异：低、中、高度致敏组PRA强度与CPRA值的一致率分别为19.36%、10.99%和100%,PRA强度与CPRA值的一致程度存在显著的统计学差异(Kappa=0.09,P<0.05)。结论本研究建立的CPRA方法,是通过分析供者HLA频率建立数据库计算PRA阳性受者不可接受的HLA基因组合在该供者群体中所占的百分比,即CPRA值。研究证明,应用PRA检测HLA抗体呈低度致敏时受者实际获得移植的几率可能比PRA强度反映的低；而PRA>30%时CPRA均>30%,证实PRA>30%为肾移植的高危因素。因此,高PRA受者选择供肾更需慎重,必须进行准确可靠的PRA特异性检测,避开既往曾出现过的全部不可接受HLA基因。传统的PRA强度分析反映了肾移植受者自身的致敏程度,代表了交叉配型时与供者不相容的HLA基因,准确可靠的PRA特异性检测其不可接受的HLA基因极为重要；在此基础上,应用CPRA方法则可以如实反映受者获得移植的几率,为临床医师预测受者等待时间、选择移植方式提供依据。
【作者】罗敏；
【导师】于立新；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】肾移植；HLA配型；易感关联；相合分数；校正PRA；

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