苦豆碱抑制结肠癌细胞HT29增殖诱导细胞周期阻滞的作用及机制研究

【摘要】结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤,其发病率一直呈上升趋势,在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位。在我国,结肠癌的发病率仅次于胃癌与食道癌,且有逐年增长趋势。因此对结肠癌的病因病机及治疗方法的深入研究尤显重要。目前结肠癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗,手术的切除率可达到60%-70%,结直肠癌根治术后,50%患者复发或转移而死亡,55-80%的复发病例发生在术后2年内,大宗病例报道的术后5年生存率仍然徘徊在50%-60%左右,扩大手术范围则无法提高患者的生存率。化疗可以降低术后复发,提高临床疗效,降低转移发生率,尽可能挽救患者生命及延长生命时间。虽然外科治疗已取得很大进步,但是手术后的复发和转移是结肠癌患者死亡的主要因素,很多抗结肠癌的药物也带来很多的副作用。中药在治疗肿瘤方面,由于其副作用小,病人耐受性好等特点发挥着越来越大的作用。中药治疗结肠癌主要体现在以下几个方面：(1)中药联合手术治疗减少肿瘤复发转移、提高生存质量、增加患者免疫功能：手术切除原发病灶后,中药辅助辨证治疗,口服及灌肠应用于结直肠癌手术前后,可抑制肿瘤生长,提高机体免疫力,改善症状,抗转移及加强手术的成功率。(2)中药联合化疗减轻其不良反应：化疗是大肠癌治疗的主要手段之一,但90%肿瘤患者初次化疗都会出现恶心、呕吐、疲乏等症状。中药可减轻化疗对结肠癌和直肠癌患者造成的肠道损伤,从而间接地辅助了癌症治疗,还可减少化疗后所致的白细胞减少的发生率,降低白细胞下降的程度,可显著改善化疗导致的恶心症状,还可以提高生存质量,改善临床症状,减轻化疗的毒副反应,提高机体对化疗的耐受性,起到增效减毒的作用,提高患者的无瘤生存率。(3)中药灌肠联合化疗延长生存期：中药灌肠是直接通过直肠,药效不受消化系等诸多因素的影响,可直接作用于创面而起到抑瘤、杀瘤、止痛等作用,且操作方便,无创伤、无不良反应,有利于患者康复,故大肠癌经肛门直肠给药治疗越来越被临床所重视。苦豆碱(Aloperine,ALO)是从苦豆子(SophoraAlopecuraides,L)中提取出来的生物碱单体,属于喹诺里西啶类生物碱,但是ALO的结构与其他槐定碱、苦参碱等生物碱四环结果不同,是三环结果,具有更强的碱性。ALO具有明显的抗炎作用、抗病毒作用,具有清热、止痛、杀虫、镇痛、镇静、降温作用,其对淋球菌的抑制作用与青霉素相近,抑菌活性比苦参碱强,对活性氧自由基和脂质自由基均有清除作用,能有效地缓解结肠炎小鼠的炎症反应。有研究表明ALO有较好的抑制肿瘤增殖效果,对白血病细胞株的作用效果好于肺癌、肝癌和食管癌实体肿瘤细胞株,尤其对HL-60细胞株作用最敏感。ALO抑制结肠癌SW480的增殖,促使细胞凋亡,抑制JAK/Stat3信号通路的活化,抑制肿瘤生长。虽然对ALO抑制肿瘤细胞的增殖做了一些相关研究,但是其作用机制到目前为止还不完全清楚。本研究的目的是为了明确与其他相似类成分比较,ALO对多种细胞株的抑制作用是否具有优势及ALO体内的抗肿瘤作用,了解ALO的毒性,并对其诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的分子机制进行研究,探讨ALO抑制细胞增殖的信号通路,从而为ALO的新药开发及临床应用提供更深入的理论依据和治疗方案。ALO的来源丰富,成本低廉,ALO制剂的开发成功,将极大的有利于资源的充分利用、人民健康、生态环境、经济发展,同时将中药与现代分子生物技术的有机结合,对中药走向世界,弘扬祖国传统医药具有重要的意义。1比较苦豆子总碱和8种生物碱对消化系肿瘤的生长抑制作用比较了苦豆子总碱及所含的8种生物碱单体槐定碱、槐果碱、ALO、苦参碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、野靛碱和莱曼碱对8种消化系癌细胞株的抑制作用,8种细胞株为人肝癌细胞97H、人胃癌细胞株BGC823及6种人不同类型不同蛋白表达结肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116、HT2、LS174t和DLD1。采用MTT法检测不同药物作用癌细胞24、48、72h的抑制率,绘制抑制曲线,用SPSS13.0Probit法计算药物的IC50值。ALO的IC50值低于苦豆子总碱及其他生物碱,与阳性对照药五氟尿嘧啶(5-Fu)相似。采用重复测量方差分析法(药物-时间,浓度-时间)和析因分析法对MTT结果进行了比较,结果ALO对8种肿瘤细胞的抑制率均显著好于其他药物(p<0.001)。ALO对不同细胞的抑制率有显著差异(F=31.767,P=0.000),ALO对SW480和HT29的抑制作用最强,抑制率分别为86.54±22.99%和85.70±16.33%。2ALO诱导结肠癌HT29的细胞凋亡ALO作用于细胞后显微镜下观察可见细胞发生明显的形态变化,与对照组相比,ALO组的细胞变圆,随着给药剂量的增加,死细胞越来越多,贴壁生长的细胞变稀疏,细胞浆中的颗粒物质增多。Hochest33342-PI双染法观察细胞,紫外光下阴性对照组无明显凋亡细胞,ALO组可见早期凋亡细胞,核染色质聚集,出现断裂,胞质浓缩,为明亮的月牙状,不规则圆形、椭圆形亮蓝色荧光。阴性对照组可见少量的坏死细胞,为红色荧光,ALO组坏死细胞较对照组多。流式细胞仪PI/AnnexinV-FITC双染色法检测细胞凋亡,采用单向方差分析统计方法,不同浓度组的凋亡率比较有显著性差异(F=28.091,P=0.000)(n=3),同浓度组的早期凋亡率没有显著性差异(F=2.377,P=0.146),晚期凋亡率有显著性差异(F=38.616,P=0.000),随着浓度的增加,晚期凋亡的细胞显著增加。提示ALO对HT29细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。细胞克隆试验表明ALO在低浓度下能够长期抑制结肠癌细胞株HT29的增殖,不同浓度的ALO克隆率有显著差异(F=236755,p=0.000)(n=3),ALO在0.05mM浓度对细胞HT29的克隆率为64.11±3.87%,随着药物浓度的增加克隆率降低,0.1、0.2mmM的克隆率分别为41.89±3.91%和19.67±4.25%。Westernblot法检测凋亡的相关蛋白,细胞经过ALO作用24h后,随着浓度的增大,Bcl-2蛋白含量显著降低(F=36.436,p=0.000),而Bax蛋白含量升高(F=3.472,p=0.071),都说明了细胞发生了凋亡,而剪切的PARP蛋白含量显著升高(F=14.382,p=0.001)和PARP蛋白含量显著降低(F=10.142,p=0.001),也标志着caspase3的活跃,进一步说明细胞发生了凋亡,说明ALO对细胞的增殖抑制作用可能与细胞凋亡有关。3ALO使细胞阻滞在G2/M期并通过抑制Ras/Raf/Erk通路抑制细胞增殖流式细胞仪检测细胞周期,结果显示ALO使HT29细胞阻滞在G2/M期,qPC滋检测相关基因,ALO浓度对p53和p21的基因水平有显著影响,随着浓度的增加而增加(F=212.157,P=0.000;F=948.613,P=0.000),而CyclinB1和CyclinD1则降低(F=180.564,P=0.000;F=133.673,P=0.000).同时采用、vesternblot法检测细胞周期相关蛋白,随着浓度的增加和作用时间的延长,Ras蛋白(F=0.330,p=0.804;F=0.141,p=0.932),Raf1(F=2.395,p=0.144;F=0.288,p=0.833)和Erkl/2(F=1.150,p=0.387;F=0.872,p=0.495)的变化不显著,不同作用时间的磷酸化的Raf蛋白含量(F=11.609,p=0.003)显著降低,而不同浓度的p-Rafl蛋白含量降低不显著(F=3.475,P=0.071),磷酸化的Erkl/2的蛋白含量显著降低(F=27.914,p=0.000;F=9.744,p=0.005),表明可能是通过抑制Ras/Raf/Erk通路抑制细胞增殖。4ALO能够抑制HT29结肠癌移植瘤选用健康BALB/c-nu/nu雄性裸鼠,腋下移植HT29细胞,7-10天形成移植瘤,成功率100%。腹腔注射给药,ALO组按照高中低3个剂量组4、8、16mg/kg体重给药,隔日腹腔注射。每周给药3次,5-Fu为阳性对照药,按照30mg/kg体重给药,隔日腹腔注射,每周给药3次；移植瘤模型成功后开始给药,给药周期4周。实验结果显示ALO能够抑制肿瘤的生长,给药组对肿瘤抑制率有显著差异(F=4.216,P=0.018),组间比较,5-Fu组与ALO低剂量组有显著差异(p=0.003),与ALO中、高剂量组无显著差异(p=0.099,p=0.515),ALO低剂量组和高剂量组有显著差异(p=0.015),和中剂量组无显著差异(p=0.125)。ALO中剂量和高剂量组无显著差异(p=0.299),5-Fu组的抑制率为68.88±1.92%,ALO低剂量组为39.93±7.73%,ALO中剂量组为53.85±10.79%,ALO高剂量组为63.12-13.77%。正常对照组未见任何异常症状。试验过程中裸鼠体重逐渐下降,阴性对照组体重显著降低(F=2.172,P=0.040),阳性对照组5-Fu组的体重也显著降低(F=3.090,P=0.005),空白组体重显著增加(F=2.441,P=0.022),ALO各个给药组体重无显著变化(F=0.377,P=0.941;F=0.322,P=0.964;F=0.230,P=0.989)。试验结束解剖时发现阴性组的全部裸鼠肝脏都有白色斑点,HE染色结果可见肝脏有肿瘤细胞转移,转移率为100%,ALO低剂量、中剂量和5-Fu组为33.33%,高剂量为16.67%,脾、肾、心脏的HE染色未见异常变化。各组肝功的AST和ALT没有显著差异(F=1.439,P=0.239;F=0.396,P=0.847),组间比较,空白组和阴性对照组有显著差异(p=0.027),说明肿瘤对肝脏有一定的影响,ALO对裸鼠的肝功没有影响。Westernblot结果显示,ALO能够显著下调ERKl/2的磷酸化水平(F=18.621,p=0.001),与体外试验结果相符,表明ALO可能是通过抑制ERKl/2的磷酸化水平抑制肿瘤的生长。免疫组化结果亦显示了ALO可以抑制ERKl/2的磷酸化水平(F=65.066,p=0.000)。5ALO腹腔注射急性毒性试验为了考察ALO的毒性及毒性反应,进行了ALO腹腔注射急性毒性试验。采用传统的LD50方法,用昆明种小鼠,雌雄各半,根据不同剂量小鼠的死亡率采用spss13.0Probit法计算LD50值,结果ALO的LD50值为200.54mg/kg体重。试验中发现雌鼠的耐受性比雄鼠差,死亡数量比较多,小鼠的中毒时间比较短,中毒症状比较明显,最主要的症状就是抽搐、紫绀,死亡小鼠都是在30min内死亡,超过1h后中毒症状基本减轻,之后再无死亡。ALO的急性毒性结果表明ALO具有一定的毒性。结论综上所述,我们的研究证实了ALO可以抑制结肠癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。1.ALO对8种消化道细胞的抗肿瘤作用好于苦豆子总碱及其所含的7种生物碱单体。其中ALO对结肠癌细胞HT29和SW480最为敏感,抑制效果最好。2.ALO抑制HT29结肠癌胞株增殖并诱导其发生凋亡,流式细胞仪检测凋亡率随着浓度的增加,凋亡率增加,ALO作用于细胞使细胞形态发生变化,并下调了癌基因Bcl-2,上调了抑癌基因Bax的蛋白水平。3.ALO使HT29细胞周期阻滞在G2/M期,上调了p53、p21蛋白和基因水平,下调了cyclinD1和cyclinB1的蛋白和基因水平,并通过抑制RAS/RAF/ERK信号通路的蛋白抑制细胞的增殖。4.ALO腹腔注射的急性毒性试验,LD50为200.54mg/kg体重,95%可信区间为189.59mg/kg体重-211.84mg/kg体重。说明ALO具有一定毒性。ALO的毒性主要表现为神经毒性,小鼠给药后30min死亡,恢复期内小鼠没有死亡,表明ALO的毒性作用时间短。5.ALO的体内抑制移植瘤的结果显示,HT29细胞移植瘤的成功率为100%,ALO对肿瘤的抑制率为63.12%,与5-Fu组没有显著差异。ALO还能够抑制HT29细胞的肝转移,阴性对照组裸鼠全部发生肝转移,而ALO的三个对照组部分发现肝转移。AST和ALT检测结果显示ALO对肝功能没有显著影响。免疫组化和westernblot结果表明ALO能够抑制肿瘤组织的ERK蛋白的磷酸化,ALO可能是通过抑制ERK蛋白磷酸化抑制肿瘤的增殖。
【作者】张丽；
【导师】邓虹珠；
【作者基本信息】南方医科大学，中药学，2014，博士
【关键词】ALO；结肠癌；细胞凋亡；细胞周期；HT29；Ras/Raf/Erk；信号通路；

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