Duffy抗原趋化因子受体（DARC）在瘢痕疙瘩成因中的作用

【摘要】一、研究背景及目的瘢痕疙瘩是一类创伤异常愈合所致的疾病,主要以纤维组织异常增殖以及胶原纤维过量沉积为主要标志,通常在创伤后持续存在,不能自行消退,且常超过原创伤范围,侵犯周围正常的皮肤组织。瘢痕疙瘩不仅会导致持续的瘙痒以及疼痛等症状,还会导致功能异常甚至畸形,严重影响外观,给患者带来严重的心理及生理的困扰。因此,瘢痕疙瘩是整形外科面临的重大难题之一。但由于瘢痕疙瘩形成的病因尚不十分明确,对于瘢痕疙瘩的预防及治疗方案也尚难统一。所以,找寻瘢痕疙瘩的主要致病因子是诊断及治疗瘢痕疙瘩的关键。目前针对瘢痕疙瘩的研究多集中在以下3个方面：(1)细胞外基质蛋白的沉积以及降解,(2)细胞因子和生长因子,(3)凋亡通路。我们既往的研究已经对凋亡通路有了一定的探索,但仍然未能找到瘢痕疙瘩形成的关键原因。鉴于各种细胞因子与瘢痕疙瘩形成关系密切,因此我们针对细胞因子中的趋化因子及其受体进行了新的探索。趋化因子是一类与炎症介质密切相关的小分子蛋白质家族,与多种器官的炎症反应,肿瘤转移还有组织纤维化密切相关。趋化因子可促进炎症反应,血管形成,协助白细胞从血液循环进入组织,在炎症反应中,趋化因子可为细胞提供相互联系,趋化因子信号转导是炎症细胞从血管中迁移粘附血管壁的关键因素。关于趋化因子与瘢痕疙瘩的研究已经展开。MGSA/GROα以及其受体CXCR2仅在瘢痕疙瘩组织中检测到表达,而增生瘢痕和正常上皮组织中则没有检测到其表达。并且其免疫组化的染色阳性率与该区域炎症反应的程度呈正相关。此外还有报道关于MCP-1及其受体CCR2过度活跃与各种纤维化的病理过程密切相关,并且在多种纤维化疾病中起着关键作用。而趋化因子需与其相应受体结合而发挥作用。DARC(Duffyantigenreceptorforchemokines;Dufyantigen/receptorforchemokines,DARC)即达菲抗原受体或称达菲抗原/趋化因子受体,是一个重要的趋化因子诱骗受体,该受体首先是在血友病患者中发现。它是红细胞膜上的糖蛋白,能够结合CC族和CXC族趋化因子的杂性趋化因子受体。作为典型的趋化因子诱骗受体,DARC只与具有促进血管生成作用的趋化因子结合,由于缺乏位于第2个胞内环上的与G蛋白偶联受体相似的7次跨膜糖蛋白,与配体结合后并不引起细胞信号转导和细胞代谢的改变。有研究发现除了在红细胞上有表达外,DARC同样也在内皮细胞、淋巴结、淋巴管上皮细胞、血管静脉和肺、肾上皮细胞中同样有表达。DARC在炎症反应中发挥着重要的作用,主要通过对其受体的调节,调控白细胞的归巢,影响炎症反应,炎症反应可以上调DARC的表达,而DARC的表达也可以对炎症反应进行调控。DARC在不同时期发挥的不同作用主要包括：1)趋化因子释放入血；2)血液中趋化因子的改变；3)血浆中趋化因子的转录后调控；4)趋化因子相关的DARC开／关比率；5)依赖DARC的转运机制。DARC的表达还与许多肿瘤呈负相关,如前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌以及食管癌中都发现DARC高表达患者其预后优于低表达者。尽管瘢痕疙瘩是一种良性的上皮纤维异常增殖性肿瘤,没有恶性征象,但瘢痕疙瘩的某些特征,包括持续性生长,超出原有创伤范围,切除后容易复发等,又与恶性肿瘤有一定相似性。至今尚未有关于DARC与瘢痕疙瘩相关性,以及其在瘢痕疙瘩形成过程中所占的地位的报道,鉴于DARC对趋化因子调节的重要地位和其在炎症反应,以及肿瘤发生发展中所起的作用,瘢痕疙瘩的部分恶性肿瘤征象等理由,我们猜想DARC的表达可能与瘢痕疙瘩的形成有着一定的相关性。若能弄清DARC在瘢痕疙瘩形成中的作用,势必为瘢痕疙瘩的治疗和预防打开新的思路。为了研究DARC在瘢痕疙瘩和正常皮肤中的表达情况及其在瘢痕疙瘩形成中的作用与机制,我们首先对不同的人瘢痕疙瘩和正常皮肤进行了检测,以确定它们表达DARC的情况。并且分离培养了部分瘢痕疙瘩患者和正常皮肤组织中的成纤维细胞,对其中DARC的mRNA含量及蛋白含量进行分析。此外还对其部分受体(?)IL-8,MCP-1以及与瘢痕疙瘩胶原沉积异常相关的MMP-2在瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中的表达进行了研究,并且观察在DARC表达改变的情况下这些受体及蛋白的表达情况,还对DARC是否影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和细胞周期,及其迁移的影响进行了研究。本研究旨在为发现趋化因子受体在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对成纤维细胞生长、迁移的影响,并深入研究其机制,对瘢痕疙瘩的成因及从根本上治疗瘢痕疙瘩提供理论依据。二、材料与方法材料：收集2007年1月至2012年广东省中医院和南方医院病理确诊瘢痕疙瘩标本30例,以及正常对照皮肤30例。本研究事先得到南方医院相关审核部门的同意,所有研究对象签署知情同意书。指定2名对瘢痕疙瘩诊断和治疗具有丰富临床经验的整形外科医师,根据瘢痕疙瘩诊断标准,对所有研究对象进行全面的体格检查、详细的病史询问和准确的临床诊断,填写个人临床资料登记表,并严格遵照赫尔辛基宣言的规定采集他们的组织。方法：2.1瘢痕疙瘩中DARC表达的检测将组织用石蜡包埋后切成石蜡切片,经过免疫组化染色,检测组织中DARC的表达情况。检测新鲜瘢痕疙瘩及正常皮肤中DARCmRNA及蛋白含量。2.2细胞原代培养将3例瘢痕疙瘩和3例正常皮肤组织进行体外细胞培养,培养出相应的成纤维细胞。将传代小于15代的成纤维细胞用于以下实验。2.3运用siRNA干扰DARC表达取处于对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于六孔板中,待其长至板底的60%-80%时依据转染试剂所提供步骤,各孔分别用细胞培养液+转染溶液；controlsiRNA+转染溶液,以及DARCsiRNA+转染溶剂进行转染,转染后24h及48h分别检测DARCmRNA及其蛋白的表达,并进行其余相关实验。2.4细胞增殖影响将瘢痕疙瘩成纤维细胞按5000个/孔的浓度将处于对数期的细胞种至96孔板,基础培养基100m1,每孔设3个对照；分别在12h,24h,48h,72h对细胞增殖进行检测；在每孔细胞中加入10μCCK-8溶液,细胞培养箱内继续孵育1.5h；MD5多功能酶标仪在450nm测定吸光度。2.5细胞周期检测将细胞计数1×105/瓶的NF(正常皮肤成纤维细胞组),KFC(瘢痕疙瘩成纤维细胞空白对照组),KFP(瘢痕疙瘩成纤维细胞阴性对照组),KFS(瘢痕疙瘩成纤维细胞干扰组)细胞在转染后24h进行细胞周期检测我们通过流式细胞仪对细胞周期的变化进行检测。2.6细胞迁移的改变我们通过划痕实验和transwell实验对正常皮肤成纤维细胞以及转染后的瘢痕疙瘩成纤维细胞进行检测,观察其迁移能力和增殖能力改变的情况。2.7细胞上清液中蛋白的检测我们通过ELASA检测正常皮肤成纤维细胞以及转染后的瘢痕疙瘩成纤维细胞中IL-8,MCP-1和MMP2蛋白的表达及变化情况。三、结果3.1DARC为胞膜和细胞浆着色,在正常皮肤及瘢痕疙瘩组织的阳性染色组织中,均可见部分染色的成纤维细胞的细胞浆及细胞膜。对比30例瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中成纤维细胞DARC表达情况,发现瘢痕疙瘩成纤维细胞的DARC高表达率高于正常皮肤组织。3.2通过进一步对3例瘢痕疙瘩组织和3例对照正常皮肤组织中DARCRNA以及蛋白的检测,同样发现瘢痕疙瘩组织中DRAC含量在mRNA水平与蛋白水平均高于正常皮肤。在对体外培养的3组瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞进行DARCRNA及蛋白检测后,发现其DARC表达与组织中的表达规律基本一致。3.3转染后的细胞生长曲线测定比较,发现转染DARCsiRNA对细胞增殖并无明显影响,并且瘢痕疙瘩与正常细胞成纤维细胞生长增殖无显著差异。流式细胞仪检测发现DARCsiRNA转染对细胞周期无明显影响,此外瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力弱于正常皮肤来源的成纤维细胞,而干扰DARC后瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力有了一定提高,但仍稍低于正常皮肤成纤维细胞。3.4DARC表达减低对IL-8,MCP-1,MMP-2mRNA的表达无明显影响。DARC表达减少可以增加MCP-1蛋白的分泌。我们研究发现DARC的表达高低对IL-8以及MCP-1mRNA的表达无明显影响。而当对DARC进行干扰后,我们发现与对照组相比,MCP-1在细胞上清中的含量增加,但仍稍低于正常皮肤来源的成纤维细胞。而DARC干扰对细胞上清液中IL-8以及MMP2蛋白的含量无明显影响。四、讨论我们的研究结果显示,虽然有一定的恶性肿瘤表型,但与恶性肿瘤不同的是,DARC在瘢痕疙瘩组织中无论在蛋白水平还是在转录水平均高于正常皮肤组织。说明瘢痕疙瘩的形成过程与恶性肿瘤细胞不同,不是各种致瘤因素所致,可能与伤口的异常愈合相关。创伤愈合需要复杂的细胞间相互作用,以及其调控因子的调节。组织创伤修复机制的变化受制于皮肤创伤的愈合。瘢痕疙瘩中常出现细胞迁移,增殖,炎症反应,细胞外基质蛋白与细胞因子的合成及分泌异常。炎症反应是创伤愈合过程的组成部分,一方面可以作为抗感染的免疫屏障,另一方面可以导致纤维增生,闭合创面。趋化因子在创伤愈合过程中的炎症反应和组织修复中都发挥着重要的作用。而皮肤由于感染等外在因素导致的慢性炎症反应常常是瘢痕疙瘩形成的重要诱因。趋化因子对白细胞聚集的有效调控的关键在于对其运动的趋化调节,即在准确的时间到达准确的位置,并且对其的功能在一定的时间和范围进行有效控制。趋化因子是通过与其受体的相互作用对白细胞产生趋化和激活作用,从而发挥其在炎症反应中的重要功效。瘢痕疙瘩中DARC表达改变,对成纤维细胞的的生长增殖无明显影响。而瘢痕疙瘩成纤维细胞体外培养伤口愈合能力弱于正常皮肤,这也是瘢痕疙瘩伤口愈合异常的表现。在对DARC进行干扰后,成纤维细胞的迁移能力有一定提高。说明DARC可能通过对其相应的配体的结合,而影响成纤维细胞的迁移,导致伤口延迟愈合。在对DARC相应配体及MMP-2的检测中,我们发现瘢痕疙瘩成纤维细胞中IL-8,MCP-1,MMP-2的mRNA含量高于正常皮肤成纤维细胞,但仅有MCP-1在细胞上清中的表达低于正常皮肤成纤维细胞,并且MCP-1的表达受DARC的调控。在组织创伤后的炎症反应中,趋化因子的主要作用是诱导炎症因子在合适的试剂到达合适的位置,为了达到这样的效果,趋化因子的调控必须精确。炎症反应区域趋化因子及其受体的表达上调对于局部炎症细胞的快速聚集有重要意义。我们认为在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,DARC可能通过与MCP-1的结合,引起MCP-1的分泌减少。导致局部炎症反应不平衡,形成慢性炎症反应。而DARC并不在基因水平上影响其配体的表达,DARC对其配体的下调作用是一种翻译后的调控因素,是发生在蛋白质水平的,而这种作用并不影响细胞内的信号通路,不影响细胞的增殖等生物学行为,是一种趋化因子的翻译后调控。本实验首次对诱骗受体DARC在瘢痕疙瘩中的表达,及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长、迁移的影响进行了研究,并初步探讨了相关机制,为瘢痕疙瘩的病因研究打开了新的思路,也为进一步研究趋化因子及其受体在瘢痕疙瘩中形成中的作用奠定了一定的实验基础。五、结论5.1.与恶性肿瘤细胞DARC表达相反,DARC在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中表达高于正常皮肤组织的成纤维细胞；5.2.DARC并不对瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖产生影响,但我们的研究发现DARC可能会抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移,造成创口愈合异常,对其进行干扰后瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力有一定提高。5.3.DARC可能通过某种转录后调控的方式,抑制MCP-1的分泌,使成纤维细胞MCP-1分泌减少,由于DARC表达异常,导致其相关趋化因子调控异常,造成炎症反应不平衡,形成持续的炎症反应,导致组织损伤和慢性炎症形成,是瘢痕疙瘩形成的可能因素。
【作者】陈莹；
【导师】高建华；
【作者基本信息】南方医科大学，整形外科学，2014，博士
【关键词】瘢痕疙瘩；炎症反应；趋化因子；DARC；

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