大鼠同种异体肾移植前期急性排斥反应模型的建立及其预警标记物的筛选

【摘要】研究背景：肾移植已经成为终末期肾病患者的主要治疗手段之一。随着强有效的移植免疫研究及新型免疫抑制剂药物的持续开发,使移植物的短期存活时间获得了很大程度的提高,然而移植物长期存活率并没有得到根本改善。影响移植肾存活的因素很多,主要分为移植前、后两方面因素。移植前的因素主要包括脑死亡及器官缺血时间；移植后的因素中主要包括再灌注损伤、感染、排斥反应、肾毒性等。而导致上述相矛盾性结果的主要原因可能是1.等待肾移植的患者数量逐年增加导致供体肾脏总体质量下降；2.免疫抑制剂药物的肾毒性；3.急性排斥反应或者慢性排斥反应发生的亚临床症状的隐匿性增加等。其中急性排斥反应是肾移植术后最为常见的并发症。移植肾功能的丧失意味着受者需要再次接受移植治疗,这无疑会加重器官极度短缺的现状及浪费更多的卫生资源。所以如果移植前肾损伤因素相同的情况下,移植后肾损伤应该降低到最低。因此,移植术后的实时监测特别是急性排斥反应的前期、及时监测与发现对改善移植肾脏功能、延长患者的长期存活以及降低医疗费用等能提供重要意义。目前肾移植术后肾功能的监测方法主要是1.通过常规检查血清肌酐值,但是血清肌酐值的变化已经晚于移植肾功能相关蛋白的前期变化；2.细针穿刺活检仍然是移植肾脏急性排斥反应诊断的“金标准”。但是,移植肾脏前期急性排斥反应的病理变化不明显,因此病理诊断落后于移植肾脏本身前期已经发生的分子变化,这无疑会延误患者的病情诊断及对受者术后有效性的干扰治疗同时细针穿刺存在很多局限性,包括1.在短期内不能反复进行；2.可能导致移植肾脏急性损伤的发生；3.穿刺部位不准确导致的误诊及损伤邻近器官；4.同时不利于受者的动态随访观察。所以临床医生急需寻找一种无创、前期、安全、有效的方法来替代目前的检查方法从而更准确的判断急性排斥反应的发生并指导术后免疫抑制药物的治疗。针对这一需求,通过检测受者血清及尿中相关标记物己成为该领域研究的热点。无创性标记物的发现可能弥补上述不足,提供对移植术后免疫反应、组织损伤、免疫药用治疗等实现实时监测。以往报道中大部分的研究都集中在细胞毒性T细胞的效应蛋白及相关免疫分子上。然而,参与肾急性排斥反应的发生机制还有待于进一步阐明,可能还存在着其它因素的共同参与,比如炎症、肾小管急性损伤、氧化应激等等。本课题主要通过监测同种异体肾移植大鼠模型中血清的NGAL,KIM-1,CRP,MDA以及sHLA-DR的变化,并试图找出它们在肾移植大鼠中血清的表达与肾急性排斥反应早期发生的相关性,从而对大鼠早期肾急性排斥反应发生进行预警作用。而针对初学者而言如何快速、简单、有效的建立大鼠肾急性排斥反应模型对于今后整个实验的研究开展是至关重要的,也是整个实验过程中首要的。此外,选择大鼠同种异体肾移植模型有许多优点：它容易获取,研究费用低,便于管理,且可以进行同源基因移植研究等。但是选择大鼠同种异体肾移植模型也有不足,它表现为大鼠个体小,血管吻合难度大,一般需经过至少3个月的显微外科训练,限制了其研究应用,尤其是对初学者而言面临着更大挑战。我们通过文献的学习以及多次反复的训练改进,本课题还同时对大鼠同种异体肾移植模型方法进行了改进与评估,特别是供受体之间结合硬膜外导管内支架技术进行肾静脉端端吻合,并与目前推荐的肾静脉吻合方法进行比较。我们建立了一种稳定的、简单、有效的大鼠肾移植模型,尤其是初学者容易掌握学习。目的：1、寻找一种稳定的、简单、有效的大鼠同种异体肾移植模型,尤其适合初学者掌握学习,为大鼠肾移植急性排斥反应的研究开展提供首要的条件。2、探讨同种异体肾移植大鼠模型中血清的NGAL、KIM-1、CRP、MDA以及sHLA-DR的变化,从而寻找出它们与大鼠早期肾急性排斥反应发生预警作用的关系。为大鼠早期肾急性排斥反应的监测及早期防治提供依据。方法：1.正常SD雄性大鼠为供体,Wistar雄性大鼠为受体,建立稳定的同种异体肾移植大鼠模型。。肾动脉采用端、侧连续缝合,肾静脉采用端端连续与间断缝合,输尿管采用膀胱瓣连续缝合,进行供、受体左侧同种异体大鼠原位肾移植。对大鼠同种异体肾移植术后第3、4个月连续进行45次手术进行评估。2.雄性Wistar大鼠分别作为供者和受者,进行大鼠同种异体原位肾移植模型的建立。我们采用肾静脉内置入硬膜外导管作为内支架进行端端吻合的方法,并进行方法改进,同时记录同种异体肾移植大鼠移植后的生存率、热缺血时间、肾静脉吻合时间以及术中、术后的并发症进行统计分析,并与目前多数文献报道的大鼠供、受体之间肾静脉吻合方法进行比较。并由两个初学者参与实验,每个初学者分别采用两种方法连续进行30台实验。3.分别采用Brown-Norway(BN)原位肾移植到Lewis大鼠中作为实验组以及Lewis大鼠原位肾移植到Lewis大鼠中作为对照组。并分别在同种异体肾移植术后第3、5、7天处死大鼠,每个亚组共重复五只,同时留取各组大鼠的血清标本用于检测血清NGAL、KIM-1、CRP、MDA以及sHLA-DR的表达水平以及肌酐值,同时对移植物进行组织病理学切片染色。此外,我们还对移植物的NGAL蛋白进行评估分析。结果：1.按照文献报道大鼠同种异体肾移植术后存活3天以上认为肾移植造模成功。统计第3、4个月造模练习结果,两个月总共连续移植45次供受体手术。其中存活超过3天以上的受体为52只,成功率达86.7%；术后3天内死亡的受体数量为6只,分别为麻醉意外1只、低血容量1只、血栓2只、低体温2只。受体肾动脉吻合时间(15±1.5min),肾静脉吻合时间(15±1min),总时间(30±2min)。2.与目前推荐的大鼠肾静脉吻合术相比较,初学者采用硬膜外导管的改良技术进行大鼠同种异体原位肾移植建模可以获得较短的学习曲线。同时,两种大鼠同种异体原位肾移植静脉吻合术的术中并发症及术后并发症也进行评估分析。采用目前推荐的大鼠肾移植方法中,两名初学者出现的并发症分别为静脉狭窄6例,血栓形成9例,吻合口渗漏7例,血管痉挛4例,肾静脉损伤3例。而采用改良后的技术可以很好的减少上述并发症的发生率。两名初学者采用改良后的技术进行大鼠肾移植是发生的并发症概率分别为肾静脉狭窄0例,血栓形成3例,吻合口渗漏0,血管痉挛3例和肾静脉血管1例。初学者采用两种方法进行的大鼠肾移植中肾静脉吻合并发症的发生率有统计学差异(P<0.01)。3.在对照组中肾移植术后血清中NGAL、KIM-1水平第5、7天的值与第3天相比较,有所降低,但没有统计学差异(P>0.05)。但是在实验组中,大鼠同种异体肾移植术后血清中第3、5、7天NGAL和KIM-1水平较对照组有统计学意义(P<0.01),并且在实验组第3、5、7天中它们的血清水平组内比较也有统计学意义(P<0.01)。大鼠同种异体肾移植术后对照组中血清CRP及MDA表达水平在肾移植术后第3、5、7天之间并没有统计学意义(P>0.05)。而在实验组中大鼠同种异体肾移植术后血清中第3、5、7天CRP及MDA表达水平较对照组有统计学意义(P<0.01)。此外,在本研究中,大鼠同种异体肾移植术后实验组与对照组中血清HLA-DR水平没有统计学意义(P>0.05)。但是它的血清表达有一定的波动性。结论：1.我们推荐初学者进行大鼠同种异体肾移植模型的建立组合是：肾动脉采用腹主动脉套囊端、侧连续缝合,肾静脉结合硬膜外导管以及端、端连续及间断缝合,输尿管采用膀胱瓣连续缝合,进行供、受体左侧原位大鼠肾移植。它是一种稳定的、简单的、有效的大鼠肾移植模型,初学者容易掌握学习。2.通过供受体之间的肾静脉管腔内插入3mm长度硬膜外导管充当肾静脉内支架管这一技术是一种简单的、可靠的、有效的大鼠同种异体肾移植模型。它可以有效的缩短初学者对大鼠同种异体原位肾移植的学习曲线。此外,肾静脉管腔内插入3mm长度硬膜外导管充当静脉支架管的技术还可能应用到其他动物器官移植模型的肾静脉吻合。3.通过检测大鼠同种异体肾移植模型血清中NGAL、KIM-1、CRP和MDA含量的表达水平可能对大鼠同种异体移植模型中前期肾急性排斥反应进行提前预警。它们在血清中的异常表达要早于大鼠同种异体肾移植急性排斥反应组织病理学上的变化及其肌酐的变化。从而可以让我们在早期就可以对大鼠同种异体急性排斥反应的发生进行提前干预,进一步减少急性排斥反应带给大鼠同种异体肾移植物的损害,从而增加大鼠同种异体移植肾的存活率及其早期预防移植术后并发症的发生。
【作者】叶东明；
【导师】苏泽轩；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】大鼠；肾移植；急性排斥反应；模型；标记物；

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