拉莫三嗪改善阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因模型小鼠认知功能的实验研究

【摘要】阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是以p-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积与tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结为特征的神经退行性疾病。不断增多的Ap和神经纤维缠结进一步引起慢性神经炎症反应,导致突触、神经元缺失,以及进行性的认知功能障碍。目前认为,靶向针对增多的Ap和tau蛋白过度磷酸化是治疗AD的主要策略。文献报道AD患者表现出更高的癫痫发生率,并且在大量的AD转基因动物模型脑内均发现存在神经网络异常兴奋性的现象。这种神经网络活动异常兴奋性以及海马代偿性产生的抑制性机制可能是导致AD以及AD转基因动物模型认知障碍的原因。因此,靶向针对性抑制脑内神经网络的异常兴奋性,可能有效抑制AD的进行性学习与记忆障碍。Sanchez等人研究发现,抗癫痫药物左乙拉西坦通过抑制脑内神经网络异常兴奋性显著改善mAPPJ20AD转基因小鼠认知能力的作用。这些研究成果为抗癫痫药物在AD治疗上的运用提供了一种新的策略。但并不是所有的抗癫痫药物都显示出这样的疗效。另一些抗癫痫药物反而会加重AD脑内异常的神经网络活动并且导致认知功能进行下降,如钠离子通道抑制剂苯妥英钠、卡马西平、苯巴比妥、普瑞巴林以及苯二氮卓类抗癫痫药物等。因此,本实验拟研究抗癫痫药物拉莫三嗪能否抑制AD转基因小鼠脑内神经超兴奋性,能否改善记忆功能的作用,并探讨其可能的分子机制。拉莫三嗪(lamotrigine,LTG)是一种广谱的抗癫痫药物,用于12岁以上儿童及成人具有简单部分性发作、复杂部分性发作、继发性全身强直-阵挛性发作及原发性全身强直-阵挛性发作等癫痫的治疗。拉莫三嗪尤其对老年女性癫痫患者显示了独特的显著疗效。此外,LTG还运用于治疗双向躁狂抑郁障碍、精神分裂症以及偏头痛、神经痛等其它神经系统疾病。更引人注意的是,拉莫三嗪对成年癫痫患者有改善认知功能的作用。Tekin等人用LTG治疗诊断为AD的11例病人中,发现能显著改善患者认知能力与命名能力,并且还显著改善患者抑郁情绪,显示了良好的疗效。但是,LTG能否有效抑制AD脑内异常的神经网络活动,是否能改善AD患者的认知功能,还不得而知。本研究运用抗癫痫药物LTG治疗ADAPP/PS1(hAPPswe/PS1dE9)转基因模型小鼠,观察对其病理与行为的影响及探讨可能的分子机制。本研究发现,LTG长期处理能有效改善APP/PS1小鼠突触可塑性、抑制脑内Ap的沉积和神经元的缺失,改善APP/PS1小鼠的学习与记忆功能。LTG突触可塑性的改善作用可能与上调APP/PS1脑内脑原性神经生长因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)与神经生长因子(Nervegrowthfactors,NGF)的水平,还可能与调控环憐酸腺苷反应单元结合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein,CREB)磷酸化水平有关。此外,LTG可能通过下调APP/PS1转基因小鼠糖原合酶激酶3-β(Glycogensynthasekinase-3p,GSK-3β)磷酸化水平,降低β-分泌酶(p-secretase,BACE1)的水平,减少Aβ的神经病理损害,改善记忆功能。第一章拉莫三嗪有效改善阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9转基因模型小鼠的认知功能目的：研究广谱抗癫痫药物LTG对APP/PS1双转基因小鼠学习与记忆的影响。方法：将野生动物和APPswe/PS1dE9双转基因小鼠分为四组,各组20只,分别是：野生小鼠拉莫三嗪处理组(WT+LTG);野生小鼠安慰剂对照组(WT)；APPswe/PS1dE9双转基因小鼠拉莫三嗪处理组(TG+LTG);APPswe/PS1dE9双转基因小鼠拉莫三嗪安慰剂对照组(TG)。各组小鼠在3个月龄大小时候开始给以添加了拉莫三嗪和安慰剂的饲料饲养,每天饲养两次,处理5个月,四组小鼠在8个月龄时,应用水迷宫和新物体识别等行为学评估抗癫痫药拉莫三嗪对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习与记忆的影响。结果：水迷宫隐蔽平台实验中,重复测量方差分析统计结果显示：各实验组小鼠逃逸潜伏期的分组效应(F=18.343,P=0.000)、时间效应(F=14.461,P=0.000)与游泳距离的分组效应(F=14.211,P=0.000)、时间效应(F=19.090,P=0.000)差异具有显著性,说明分组因素和时间因素对各组动物空间学习记忆能力有影响。相比野生小鼠,对照组APP/PS1转基因小鼠逃逸潜伏期、游泳距离明显延长；而拉莫三嗪处理组APP/PS1转基因小鼠的逃逸潜伏期、游泳距离比对照组APP/PS1转基因小鼠明显减少；为了排除速度的影响,我们将每组小鼠的第一天逃逸时间标准化为1,以后每组每天的逃逸潜伏期与第一天的进行比较,观察各组动物的学习趋势,结果显示,野生对照组和野生处理组小鼠均显示了良好的学习趋势,而转基因对照组却没有一个不断学习的趋势,给以拉莫三嗪处理后,转基因小鼠随着训练时间也呈现了良好的学习趋势。野生对照组与野生处理组间逃逸潜伏期、游泳距离与标准化潜伏期无显著差异。水迷宫空间探索实验中,拉莫三嗪处理组APP/PS1/J、鼠比对照组小鼠穿越平台象限区域的次数明显比对照组小鼠增多(F=3.919,P=0.021)。新物体识别实验中,各组小鼠对放在矿场区角落处两个相同的物体A没有特别的偏爱,不影响各组动物下一步对新物体B的开采行为(F=0.314,P=0.815)。在开采实验阶段,转基因对照组小鼠对新物体B的认知指数相比野生型小鼠更少,显示出它们有记忆障碍(P=0.001)。而APP/PS1拉莫三嗪处理组模型小鼠较对照组有显著增高的认知指数(P=0.006),野生对照与野生拉莫三嗪处理组之间识别指数差异无统计学意义(P=0.183),说明拉莫三嗪可以改善APP/PS1小鼠的记忆障碍,而不影响正常小鼠的行为认知功能(F=5.370,P=0.005)。结论：8个月龄的APP/PS1转基因小鼠有明显的学习、记忆损害；抗癫痫药物拉莫三嗪能有效改善PP/PS1转基因小鼠的学习与记忆能力；LTG对正常小鼠的学习记忆能力无影响。第二章拉莫三嗪对APPswe/PS1dE9转基因小鼠神经网络活动及阿尔茨海默病相关病理的作用研究目的：研究拉莫三嗪长期治疗对APPswe/PS1dE9转基因小鼠神经网络活动的调控作用及AD病理变化的影响。方法：将动物分为WT,WT+LTG,TQTG+LTG四组,每组6只。在动物3个月龄大小时候分别给以拉莫三嗪和安慰剂治疗2个月,在5月龄大小的时候监测皮层、海马脑电图,评估APP/PS1转基因小鼠脑内脑电活动,评估抗癫痫药物LTG对APP/PS1转基因小鼠脑内脑电活动的影响。其余实验在各组小鼠行为学结束后,灌注固定,取材,切片,进行病理学分析。用免疫组织化学法评估拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠皮层、海马Ap沉积的影响,免疫荧光方法评估抗癫痫药物拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠脑内GFAP、IBA-1、NPY、NeuN表达的影响。结果：各组小鼠脑内皮层、海马脑电波节律差异具有显著性(F=41.73,P=0.000、F=31.72,P=0.000)。相比WT组,TG组小鼠皮层、海马内均可见明显异常高尖的癫痫样脑电波(P<0.01),存在异常的神经网络活动；而TG+LTG组皮层、海马高尖异常的脑电活动得到了明显的抑制(P=0.005、P=0.008),显示APP/PS1小鼠脑内异常的神经网络活动得到有效的抑制。WT组与WT+LTG组小鼠皮层、海马未见明显异常节律的脑电活动(P=0.973)。NPY免疫荧光结果显示,各组小鼠皮层、海马NPY阳性细胞表达差异具有显著意义(F=3.157,P=0.036；F=3.297,P=0.031),TG组小鼠脑内皮层、海马NPY阳性细胞表达比WT小鼠显著增高(P=0.010、P=0.010),而TG+LTG组皮层、海马NPY阳性细胞表达比TG组小鼠明显降低(P=0.041、P=0.041)。TG组小鼠脑内可见一定数量和体积大小的Ap沉积,TG+LTG组小鼠皮层、海马Ap沉积的数量(t=1.154,P=0.042;t=0.158,P=0.019)和体积大小(t=-1.71,P=0.013；t=-0.565,P=0.01)相对TG组小鼠明显减少；与WT组相比,TG组小鼠皮层可见神经元的数量显著减少(P=0.023),而TG+LTG组小鼠皮层神经元的数量比TG组明显改善(P=0.047),接近WT组小鼠的水平。各组海马神经元的数量无显著差异(F=1.047,P=0.385)；各组小鼠脑内皮层、海马星型胶质细胞和小胶质细胞表达差异具有显著性(F=23.379,P=0.000;F=22.968,P=0.000)(F=40.96,P=0.000;F=38.577,P=0.000)。相比WT组,TG小鼠皮层、海马GFAP+、Iba+细胞所占的体积百分比显著升高(P<0.01),而TG+LTG组小鼠皮层、海马GFAP+(P=0.027、P=0.018)、Iba+(P=0.011、P=0.022)细胞所占的体积百分比明显降低；WT组和WT+LTG组两组之间GFAP+.IBA1+细胞所占体积百分比差异无统计学意义(p>0.05)。结论：APP/PS1转基因小鼠脑内存在神经网络异常兴奋性现象；抗癫痫药物拉莫三嗪能抑APP/PS1转基因小鼠脑内神经网络异常兴奋性；LTG能显著减少APP/PS1转基因小鼠脑内Ap的沉积；LTG能抑制APP/PS1转基因小鼠脑内神经元的缺失；LTG能抑伟APP/PS1转基因模型小鼠脑内星型胶质细胞、小胶质细胞的激活,减轻脑内慢性炎症反应。第三章拉莫三嗪长期处理对APP/PS1转基因小鼠突触可塑性的影响。目的：研究LTG长期处理是否具有改善APP/PS1、鼠突触可塑性的作用。方法：将动物分为WT,WT+LTG,TG,TG+LTG四组。在动物3个月龄大小时候分别给以拉莫三嗪和安慰剂治疗5个月,在8月龄大小的时候电生理检测各组动物海马LTP(Long-termpotentiation)的情况,评估抗癫痫药物拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠海马LTP的影响；高尔基染色检测各组动物脑内树突棘的表达,评估抗癫痫药物拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠脑内树突棘突的影响；免疫荧光染色检测各组动物海马突触素蛋白的表达,评估抗癫痫药物拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠海马突触素蛋白的影响。结果：为了评价拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠的突触可塑性的影响,我们用电生理分别记录了4组(WT,WT+LTG,TG,TG+LTG)CA1区锥体细胞层的LTP的改变。在前30分钟的基本刺激条件下,其基础fEPSP曲线保持稳定。当给各组高频强直刺激后,LTP诱发成功并持续记录60分钟。TG组小鼠fEPSP的幅度、初始面积比WT组小鼠显著减少,显示了APP/PS1转基因小鼠脑内LTP受损害；而TG+LTG组小鼠其fEPSP幅度、初始面积较TG组小鼠都明显增加,说明拉莫三嗪有效改善APP/PS1转基因小鼠LTP(F=15.631,P=0.001;F=8.625,P=0.000);WT组与WT+LTG组小鼠fEPSP幅度、初始面积两组差异无统计学意义(P>0.05)。通过高尔基染色方法对各组动物皮层、海马树突棘的观察,并进行统计,结果显示,各组动物皮层、海马树突棘差异有显著意义(F=2.707,P=0.054;F=2.906,P=0.043)。TG组小鼠皮层、海马内树突棘的密度比WT组小鼠明显减少,大量的树突棘受到损害,突触可塑性受限,LTP损害(P=0.037、P=0.009)；然而,拉莫三嗪长期处理后的TG+LTG组小鼠皮层、海马的树突棘密度比TG组小鼠明显改善,单位长度树突棘数量增多,长度变长,头端变粗,突触可塑性得到一定的恢复(P=0.039、P=0.031)；拉莫三嗪对正常小鼠的突触可塑性无影响,表现为WT组与WT+LTG组小鼠树突棘密度差异无统计学意义(P=0.649、P=0.603)。此外,突触素蛋白SYN免疫荧光染色结果与高尔基染色结果相一致,各组动物海马SYN荧光密度差异有统计学意义(F=7.282,P=0.000),表现为TG+LTG组小鼠海马突触素的密度较TG组显著改善(P=0.01)。说明LTG具有显著改善突触可塑性的作用。结论：拉莫三嗪长期处理能恢复APP/PS1转基因小鼠脑内损害了的LTP；拉莫三嗪长期治疗能阻止APP/PS1转基因小鼠脑内树突棘的丢失；拉莫三嗪长期处理能阻止APP/PS1转基因小鼠海马内突触素蛋白的丢失；拉莫三嗪具有改善APP/PS1转基因小鼠突触可塑性的作用。第四章拉莫三嗪对APPswe/PS1dE9转基因小鼠神经保护作用及其机制的实验研究ChapterIV.TheexperimentalresearchoftheneuroprotectiveroleoflamotrigineinAPPswe/PS1dE9mice目的：研究拉莫三嗪对APP/PS1转基因小鼠的神经保护作用及可能的分子机制。方法：将动物分为WT,WT+LTG,TG,TG+LTG四组。在动物3个月龄大小时候,分别给以含有拉莫三嗪和安慰剂的饲料饲养5个月。Elisa检测WT,WT+LTG,TG,TG+LTG四组动物皮层、海马BDNF、NGF和NT-3等营养因子的水平,Westernblotting检测WT,WT+LTG,TG,TG+LTG四组动物皮层、海马CREB、p-CREB、p-GSK3p、BACE1、APP、APP-CTFs的表达。结果：APP/PS1转基因小鼠皮层BDNF水平与海马NGF水平相比WT组显著降低,而LTG能升高APP/PS1转基因小鼠皮层BDNF的水平(F=4.44,P=0.041)和海马NGF的水平(F=4.505,P=0.039),海马BDNF的水平(F=1.615,P=0.261)和皮层NGF的水平(F=0.033,F=0.992)以及脑内皮层、海马NT-3的水平(F=0.73,P=0.562;F=0.186,P=0.903)差异无统计学意义；相比WT组,APP/PS1转基因小鼠脑内皮层、海马p-CREB的表达显著降低(P=0.03；P=0.02),LTG显著上调APP/PS1脑内皮层、海马p-CREB的表达(P=0.006；P=0.006),各组动物脑内皮层、海马CREB的表达无显著差异(F=0.172,P=0.912;F=0.632,P=0.613);相比WT组,APP/PS1转基因小鼠脑内皮层、海马p-GSK3β的表达显著升高(P=0.031,P=0.039),LTG显著下调APP/PS1脑内P-GSK3β的表达(P=0.011,P=0.025)；相比WT组,APP/PS1转基因小鼠脑内皮层、海马BACE1(P=0.017)、APP-CTFs(P=0.004、P=0.001)的表达显著升高,LTG显著下调APP/PS1脑内皮层、海马BACE1(P=0.002、P=0.032)、APP-CTFs(P=0.011、P=0.010)的表达。结论：LTG提升APP/PS1转基因小鼠脑内BDNF、NGF营养因子水平,显著上调APP/PS1脑内p-CREB的表达,改善突触可塑性,保护神经功能；LTG具有减少APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积的作用可能是通过抑制GSK3β的磷酸化,抑制GSK3p活性,下调BACE1水平,减少Aβ的生成。
【作者】张茂营；
【导师】徐如祥；马全红；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科，2014，博士
【关键词】拉莫三嗪；APPswe/PS1dE9；转基因小鼠；阿尔茨海默病；抗癫痫药物；突触可塑性；海马组织；树突棘；动物模型；学习与记忆；

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