HPV16 E7调控MicroRNA-27b影响宫颈癌细胞增殖和凋亡的机制研究

【摘要】宫颈癌在女性肿瘤中的发病率排在第二位,是恶性程度最高的肿瘤之一,全球每年有将近50万的妇女被诊断为宫颈癌,其中将近一半患者死亡。我国由于筛查得不到普及,疫苗的应用还有待中国人群临床试验的完成,且价格昂贵,使用受限,我国的发病率和死亡率占全球四分之一,严重威胁女性健康。对于中晚期宫颈癌患者,尚无有效的化疗药物,因此寻找宫颈癌治疗靶点,开发有特异性的分子靶向药物和预后评价指标具有重要的现实意义。已经证实,宫颈癌与高危型HPV感染有关,可在99.7%的宫颈鳞癌和94%-100%的宫颈腺癌中检出,其中,最常见的感染类型是HPV16和HPV18。HPV阳性宫颈癌所有的恶性细胞包含至少一个拷贝的具有转录活性的病毒基因组。病毒DNA随机整合在宿主基因组中,癌基因E6和E7才能维持高表达,这被认为是宫颈癌发生的必要和限速步骤。E6和E7表达的失控增加基因组的不稳定性,并累积细胞遗传和表观遗传改变,最终这些改变能激活癌基因、失活抑癌基因,引起部分细胞选择性生长并发生恶性转化。高危型HPVE6和E7可分别作用于肿瘤抑制因子p53和pRb。E6能够经泛素化途径诱导肿瘤抑制蛋白p53的降解。E7通过保守的LxCxE模序与Rb家族成员Rb结合,磷酸化Rb蛋白,使Rb-E2F复合物分解,释放E2F1,激活其转录因子的活性,进而促进c-Myc、细胞周期蛋白A和E(CyclinA/E)等表达,利于细胞内DNA的合成及细胞提前由G1期向S期转变,促进细胞增殖。近来的研究表明,非编码基因microRNA(miRNA)也在转录和转录后水平受到E6和E7的调控。miRNA是在真核生物中发现的、内源性的、具有调控功能的非编码RNA,其大小约18～25个碱基。miRNA能通过与靶mRNA的特异性碱基配对引起靶mRNA的降解、抑制或活化,对基因进行转录或转录后调控。miRNA表达具有时间性和组织特异性,在生物体生长、发育,细胞分化、增殖和凋亡等过程中对转录后水平的基因表达发挥重要作用。miRNA自身,就像其他RNA聚合酶Ⅱ起始的转录一样,在转录和加工成熟水平受到调控。许多细胞转录因子,包括c-Myc、p53和E2F已经证实可以调控miRNA转录,其他因素包括与miRNA成熟和加工相关的Drosha、DGCR8、exportin5、Dicer、TRBP和Ago2等蛋白。miRNA的异常表达在大多数的人类肿瘤中都存在。miRNA参与肿瘤的形成过程,对细胞的癌基因和抑癌基因具有调控作用,可作为癌基因或抑癌基因。由于组织环境和目标基因的不同,一些miRNA在一类肿瘤中是致癌的,而在另一类肿瘤组织中起抑癌作用。宫颈癌中,也发现致癌相关的miRNA表达上调而与肿瘤抑制相关的miRNA表达下调。通过对宫颈癌组织或细胞株进行miRNA芯片或深度测序,发现宫颈癌中miR-21、miR-146a和miR-15/miR-16-1等表达上调、miR-143、miR-145、miR-218、miR-23a/b和miR-34a等表达下调。尽管HPV本身无病毒miRNA,由于高危型HPVE6/E7在宫颈癌中高表达,并影响细胞增殖、凋亡和侵袭等能力,阐明E6和E7对下游miRNA的调控作用,miRNA对下游蛋白编码mRNA靶点的作用,以及miRNA在蛋白间接相互作用中所扮演的角色对于了解宫颈癌的发生、发展和转移及发现新的治疗靶点具有重要意义。目前,大量的证据表明,高危型HPVE6/E7调控细胞miRNA的表达主要通过E6-p53和E7-pRb-E2F来实现,以往均是通过宫颈癌组织和正常宫颈组织,或HPV阳性的宫颈癌细胞、HPV阴性宫颈癌细胞和正常宫颈细胞进行差异miRNA的筛选,获得差异表达的miRNA后,再通过实验观察是否与E6和E7的表达有关,从而将细胞miRNA与病毒癌基因联系起来。但是,在后续的实验中,常常发现差异表达的miRNA并不受E6或E7调控。因此,本研究在HPV16阳性的宫颈癌细胞株CaSki中,采用siRNA靶向沉默E6/E7后,与未沉默的细胞进行差异的miRNA筛选,获得差异表达的miRNA谱后,再进一步利用qPCR在细胞和组织样本中验证miRNA与E6或E7的关系,富集受E6或E7调控的miRNA,为进一步研究此类miRNA的作用奠定基础。然后,选取miR-27b,在细胞水平研究其对宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用,并通过软件预测和实验验证其所作用的靶基因PLK2,经双荧光素酶报告实验确认miR-27b与PLK2mRNA3’UTR的直接作用。接着,在宫颈癌细胞中沉默和过表达PLK2,研究miR-27b通过调控PLK2如何影响细胞表型。最后,对E7上调miR-27b的机制进行初步探讨。通过siRNA靶向沉默CaSki细胞HPV16癌基因e6/e7,进行了沉默组和对照组miRNA表达差异芯片筛选,从中发现了受E6或E7沉默影响而下调的miRNA38个,上调的miRNA6个(筛选标准：变化倍数>2并且P<0.05)。根据差异倍数较大及文献报道可能与E6或E7下游通路相关的原则,从中筛选出5个miRNA(hsa-miR-20a-5p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-27b-3p,hsa-miR-93-5p,hsa-miR-106b-5p)进一步验证。在保留的miRNA芯片样本及SiHa细胞中都对5个miRNA基因进行QPCR相对定量,结果显示5个miRNA在沉默组中均下调(CaSki:hsa-miR-27b-3pt=6.73,P=0.003;hsa-miR-20a-5pt=3.65,P=0.022;hsa-miR-24-3pt=4.88,P=0.008;hsa-miR-93-5pt=18.36,P<0.001;hsa-miR-106b-5pt=7.61,P=0.002;SiHa:hsa-miR-27b-3pt=6.53,P=0.003;hsa-miR-20a-5pt=5.98,P=0.004;hsa-miR-24-3pt=4.43,P=0.011;hsa-miR-93-5pt=4.48,P=0.011;hsa-miR-106b-5pt=7.01,P=0.002),与芯片结果一致。为了解E6或E7哪个癌基因影响这5个miRNA的表达水平,构建e6、e7基因的过表达质粒,在SiHa细胞中过表达E6或E7。发现5个目标miRNA在e6或e7过表达组与阴性对照组相比均有不同程度的上调,与e6/e7沉默样本的结果一致。其中E6和E7均可使miR-20a-5p、miR-93-5p和miR-106b-5p上调,此外,E7可使miR-27b-3p上调,E6可使miR-24-3p上调。在HPV16感染的宫颈鳞癌临床样本中也证实宫颈癌组织E6、E7和5个miRNAs均较癌旁组织显著升高(E6:t=3.99,P=0.003;E7:t=3.67,P=0.004;hsa-miR-106b-5pt=2.35,P=0.041;hsa-miR-27b-3pt=3.99,P=0.003;hsa-miR-20a-5pt=2.23,P=0.049;hsa-miR-24-3pt=2.37,P=0.039;hsa-miR-93-5pt=2.31,P=0.044)。以往的研究也发现,这5个miRNA在宫颈癌细胞或组织中存在不同程度的上调,有些进行了其调控靶基因的深入研究,但未曾涉及miRNA上调的机制。与此相比,本研究提供了HPV病毒癌基因可影响hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-106b-5p表达水平的直接证据。以上miRNAs可能直接或间接受到E6或E7调控,作为促癌的miRNAs在宫颈癌的发生、侵袭和转移中起作用。为了解病毒癌基因如何调控这些miRNA的表达,miRNA表达水平的变化又如何影响肿瘤进展,我们选取了在宫颈癌中报道较少的miR-27b深入研究。通过过表达或抑制miR-27b,利用CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室细胞侵袭实验和caspase-3活性检测紫杉醇诱导的细胞凋亡实验,在细胞水平证实了miR-27b能够促进宫颈癌细胞增殖和侵袭,抑制凋亡,表明miR-27b在宫颈癌中具有促癌作用,这与乳腺癌和胶质瘤中的作用一致。为了解miR-27b是通过怎样的机制起作用,通过targetscan、microcosm和miranda在线miRNA分析软件,预测可能被其调控的靶基因,从结果交集中选取肿瘤抑制相关因子,并通过miR-27bmimics和inhibitor转染CaSki和SiHa细胞,实验验证哪个肿瘤抑制相关因子可能与miR-27b有关,结果表明PLK2mRNA和蛋白水平表达量均与miR-27b相反,这提示miR-27b可能通过转录后水平负调控PLK2的表达。预测发现,PLK2mRNA3’UTR的确存在miR-27b的作用靶点。为验证miR-27b与种子区的直接作用,构建PLK2mRNA3’UTR野生型质粒及种子区全突变质粒,经双荧光素酶报告实验发现miR-27b能显著下调转染野生型质粒细胞上清的荧光水平(t=6.04,P=0.004)而不能影响突变质粒(t=0.15,P=0.887),表明miR-27b可能是与PLK2mRNA3’UTR突变位点直接作用,转录后抑制PLK2水平。在HPV16阳性的宫颈癌组织和癌旁组织中比较miR-27b和PLK2的表达水平。发现miR-27b在癌组织显著高于癌旁组织(t=3.14,P=0.011),而PLK2则相反(t=-4.55,P=0.001)。这支持细胞实验中所发现的miR-27b对PLK2的负调控作用。为了解PLK2在哪些方面表现miR-27b的对宫颈癌细胞的作用,在SiHa细胞中过表达或沉默PLK2,研究其对细胞增殖、侵袭和紫杉醇诱导的凋亡的影响。结果表明,PLK2能抑制细胞增殖,与紫杉醇对细胞活力的抑制有关,促进紫杉醇诱导的凋亡,而与细胞侵袭能力无关。以往的研究发现,在原发性B细胞瘤和卵巢癌中,PLK2启动子受表观遗传CpG甲基化影响,转录水平可被抑制,这与肿瘤发生、复发和化疗药物不敏感均相关；而PLK2上调,可促进细胞凋亡,提高药物敏感性。PLK2还可以与TSC蛋白作用,影响mTOR信号,抑制肿瘤生长,降低细胞活力。本研究首次报道了肿瘤抑制因子PLK2在转录后水平受到miR-27b的调控,与miR-27b的促细胞增殖和影响细胞对化疗药物敏感性作用有关。初步展现了在宫颈癌细胞中存在E7-miR-27b-PLK2这样一条与细胞增殖和凋亡有关的调控途径。那么,E7又是如何使miR-27b上调的?我们尝试从miRNA加工的角度去了解这一机制。DGCR8是双链RNA结合蛋白,在miRNA的生物合成途径中具有重要作用。它可以与RNaseIII酶Drosha作用,在核中形成复合物,将初级miRNA(pri-miRNA)加工成前体miRNA(pre-miRNA)。通过QPCR或cDNA芯片检测,在肝细胞癌、结直肠癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和涎腺多形性腺癌等多种肿瘤中均发现DGCR8mRNA水平的上调,并通过增加miRNA的生成影响miRNA的水平。我们在HPV16感染的宫颈癌组织样本中发现DGCR8mRNA水平在癌组织中上调,并与E7水平有关。通过HPV16E7在SiHa细胞中的过表达和沉默实验发现,E7能上调DGCR8。接着,在SiHa细胞中用siRNA靶向沉默DGCR8,则miR-27b下调,这表明高危型HPV16感染的宫颈癌细胞中,癌基因E7可能通过上调DGCR8促进miRNAs成熟,使miR-27b上调。Guo等在卵巢癌中的研究也发现,在卵巢癌细胞SKOV3中抑制DGCR8的表达,使得部分miRNA表达异常,其中,miR-27b显著下调。在SKOV3细胞中过表达miR-27b能够明显促进细胞克隆形成能力。乳腺癌中,通过靶向沉默Drosha和DGCR8,诱导生长抑制,从中筛选出了与维持生长有关的miRNAs,其中包括miR-20a和miR-27b。这两项研究的结果与我们所发现的宫颈癌中miR-27b的上调与DGCR8的上调有关是一致的。有趣的是,有报道指出,在结直肠癌细胞HCT116中,沉默DGCR8能上调p21CIP1,下调包括miR-20a、miR-93、miR-106b等在内的miRNAs,而这三个miRNAs我们在miRNA芯片中发现与HPV癌基因E6E7有关,并进行了QPCR验证。是否在宫颈癌中HPV癌基因通过调控DGCR8影响miRNAs水平是调控miRNA的主要途径?我们在芯片样本中所发现的沉默E6E7后,差异表达的miRNA大多数表现为下调是否与此有关?都值得进一步研究。除了调控DGCR8对miR-27b进行转录后调控外,E7是否能够通过其他方式调控miR-27b的水平?乳腺癌中miR-27b表达上调可能受组蛋白乙酰化异常调控。已有研究表明,E7能通过与组蛋白去乙酰化酶结合,抑制其与E2F2启动子结合,促进E2F2的转录激活,还能通过与组蛋白去乙酰化酶HDAC1,HDAC4,andHDAC7结合,抑制其与HIF-1α作用,增强HIF-1α介导的转录激活。因此,在HPV感染的宫颈癌中,E7是否通过对组蛋白去乙酰化酶的调控,调节miR-27b的水平值得深入探讨。此外,miR-27b宿主基因C9orf3的启动子存在转录因子C/EBPalpha结合位点,在原始粒细胞分化成粒细胞的过程中,CSF-3诱导转录因子C/EBPalpha上调,促进C9orf3和miR-27b的转录激活。乳腺癌中,HER2/neu(ERBB2)、EGF和TNF-α通过AKT/NF-κB促进miR-27b表达。在宫颈癌中,E7是否能通过调控转录因子激活miR-27b的转录也值得进一步研究。通过以上研究,我们发现靶向沉默目标基因,进行差异表达的miRNA筛选,寻找受目标基因调控的miRNAs的策略是可行的。从中我们获得并验证了宫颈癌中5个受HPV16癌基因E6/E7调控的miRNAs,提供了HPV病毒癌基因可影响hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-106b-5p表达水平的直接证据。接着,我们选取miR-27b深入研究,首次报道了肿瘤抑制因子PLK2在转录后水平受到miRNA调控,发现miR-27b可以通过负调控PLK23’UTR,促进细胞增殖,影响细胞对化疗药物敏感性,展现了在宫颈癌细胞中存在E7-miR-27b-PLK2这一与细胞增殖和凋亡有关的调控途径。最后,我们发现E7能通过调控miRNA加工成熟的关键酶DGCR8,上调miR-27b,从miRNA加工成熟的角度初步探讨了E7调控miR-27b的机制,是否存在E7对miR-27b转录相关因子或启动子组蛋白去乙酰化酶的调控则有待进一步研究。本研究为将miR-27b作为宫颈癌治疗新靶点,开发特异性的分子靶向药物和预后评价指标提供了理论依据。
【作者】刘非；
【导师】王前；
【作者基本信息】南方医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】人乳头瘤病毒；宫颈癌；病毒癌基因；miR-27b；DGCR8微加工复合体亚基；Polo样激酶2；

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