肾素(前体)受体在H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及机制研究

肾素(前体)受体在H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-08 分类:参考文献 喜欢:3570
师大云端图书馆

【摘要】心肌梗死的临床研究已余百年,虽已取得迅猛卓著进展,但其治疗仍是心血管医生面临的严峻挑战。经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是急性心梗再灌注治疗的主要措施,且安全有效。但冠脉再通后常会出现心肌缺血再灌注损伤(IschamicReperfusionInjury,IRI),临床表现为急性心肌梗死患者冠脉再通,梗死心肌再灌注后段时间,有的患者却出现心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死等系列病情反而恶化的表现,严重影响患者预后,成为目前阻碍急性心梗患者急诊再灌注治疗获益的主要难题。IRI是临床常见的病理生理过程,但其机制尚未完全阐明。研究认为,氧自由基增加、钙超载、心肌能量代谢异常、中性粒细胞激活、血管内皮细胞功能障碍等均参与了心肌IRI,并互为因果,最终导致心肌细胞凋亡和坏死。在心肌IRI中,细胞凋亡起到了重要作用,介导心肌IRI细胞凋亡的信号转导途径复杂多样,也是目前的研究热点之。深入了解心肌IRI及其致心肌细胞凋亡的分子生物学机制,阻断促发心肌IRI特别是细胞凋亡的信号转导通路,抑制心肌IRI,减少心肌细胞的缺失,改善心脏功能具有极其重要的临床意义。近年来研究证实肾素—血管紧张素系统(reninangiotensinsystem,RAS)的激活参与心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程,心肌组织中血管紧张素II(AngII)水平的升高加重了心肌缺血再灌注损伤,减少AngII的生成或拮抗其作用对心肌有保护作用。肾素前体及其受体作为RAS系统的新成员,随着其逐渐在不同组织器官中均被发现而引起研究者重视。肾素(前体)受体(P)RR作为肾素及其前体的共同受体,于2002年首次被发现,(P)RR除了能激活肾素前体使其具有酶的活性外,还具有激活细胞内信号转导通路的作用。目前的研究已证实肾素(前体)与受体结合,激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/AKT等信号通路,造成血管内皮细胞、心肌细胞及肾脏系膜细胞损伤,在糖尿病肾病,高血压及其他心血管及肾脏疾病的病理生理过程中起到了重要的作用。但(P)RR在心肌IRI中的作用目前尚无人研究。本研究拟从细胞水平,应用H9c2胚胎大鼠心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation)损伤模型模拟在体IRI损伤,检测H9c2心肌细胞(P)RR的表达,应用siRNA干扰(P)RR及联合p38MAPK阻断剂,研究(P)RR介导的缺氧复氧所致H9c2心肌细胞凋亡及炎症反应的作用及信号转导机制。第一部分缺氧复氧导致肾素(前体)受体在H9c2胚胎大鼠心肌细胞中的表达变化目的:1.验证H9c2胚胎大鼠心肌细胞系中是否有(P)RR表达。2.检测siRNA干扰(P)RR效率。3.明确缺氧复氧所致(P)RR蛋白表达的变化,并进步确定使(P)RR蛋白表达最大的复氧时间。方法:1.H9c2细胞培养及传代。2.应用免疫细胞化学和免疫荧光方法检测H9c2细胞中(P)RR的表达,并结合RT-PCR半定量检测(P)RRmRNA的表达。3.检测siRNA干扰(P)RR的效率:设计三条siRNA引物siRNA653,siRNA132和siRNA965,采用realtimePCR和Westernblot法检测siRNA转染组及对照组中H9c2心肌细胞的干扰目的基因的mRNA和蛋白表达水平,以判断相应siRNA的抑制效能。4.缺氧复氧所致(P)RR蛋白表达变化的检测。实验分组:正常氧对照组(Normoxia),缺氧2小时组(2H),缺氧2小时复氧2小时组(2H/2R),缺氧2小时复氧3小时组(2H/3R),缺氧2小时复氧6小时组(2H/6R),缺氧2小时复氧12小时组(2H/12R)。应用Westernblot方法测定(P)RR蛋白表达变化。结果:1.(P)RR在H9c2胚胎大鼠心肌细胞中的表达:免疫细胞化学结果显示H9c2胚胎大鼠心肌细胞呈长梭形。免疫荧光结果显示:细胞中(P)RR表达为绿色荧光标记,(P)RR蛋白主要分布在H9c2细胞的细胞膜、胞浆和细胞核膜。RT-PCR结果显示H9c2细胞中有(P)RR基因表达特异性条带出现,分子量为275bp。2.(P)RR干扰效率的检测结果:三种siRNA干扰均可显著减少(P)RRmRNA和蛋白表达水平,后续实验选择抑制效果最显著的siRNA965。3.缺氧复氧致(P)RR蛋白表达的变化:与Normoxia组比较,2H组(P)RR蛋白表达明显上调,2H/3R组较2H组无显著变化,2H/6R组(P)RR蛋白表达进步显著上调,2H/12R组(P)RR蛋白表达较2H/6R组有所降低。故提示2H/6R组(P)RR蛋白表达量达峰。后续实验复氧时间为6小时。结论:1、(P)RR存在于H9c2胚胎大鼠心肌细胞中。2、siRNA干扰可有效的抑制(P)RRmRNA和蛋白表达水平。3、缺氧复氧可致H9c2细胞(P)RR蛋白表达显著增高,2H/6R组蛋白表达达峰。第二部分缺氧复氧所致H9c2胚胎大鼠心肌细胞凋亡及炎症反应目的:检测缺氧2小时及再复氧6小时,H9c2心肌细胞凋亡及炎症因子表达的变化。方法:1.实验分组:正常氧对照组(Normoxia组),缺氧2小时组(2H组),缺氧2小时再复氧6小时组(2H/6R组)。2.利用AnnexinV-FITC/PI双染法,通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率。3.Westernblot方法检测Caspase-3蛋白表达量。4.应用ELISA方法检测H9c2心肌细胞上清液中炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度。结果:1.细胞凋亡检测结果显示:H9c2细胞经历缺氧2小时的凋亡率为31.98%,较Normoxia组显著增加;2H/6R组的凋亡率为40.21%,较2H组进步显著增加。2.Westernblot结果显示:与Normoxia组相比,2H组凋亡因子Caspase-3相对蛋白表达量显著增高,2H/6R组Caspase-3蛋白表达进步显著上调。3.ELISA方法结果显示:与Normoxia组相比,2H组细胞上清液炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度均显著上调,2H/6R组炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度进步显著上调。结论:1.缺氧2小时,H9c2心肌细胞凋亡率及Caspase-3蛋白表达显著增加,再复氧6小时上述凋亡指标进步增加。2.缺氧2小时,H9c2心肌细胞分泌炎症因子TNF-a,IL-6和TGF-β明显增加,再复氧6小时炎症因子分泌进步增加。第三部分肾素(前体)受体介导的H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的信号转导机制目的:利用siRNA干扰及联合p38MAPK抑制剂,从p38MAPK途径初步探讨(P)RR介导的缺氧复氧所致H9c2心肌细胞凋亡及炎症反应的信号转导机制。方法:1.实验分组:根据缺氧复氧干预分组:正常氧对照组(Normoxia);缺氧2小时组(2H);缺氧2小时复氧6小时组(2H/6R)。根据阻断(P)RR及其信号通路分组:对照组(Control);siRNA干扰(P)RR组,即siRNA(+)组;只加入lipo2000的siRNA阴性对照组,即siRNA(-)组;加入P38阻断剂组SB203580,即SB203580组;加入lipo2000和SB203580组,即siRNA(-)+SB203580组;siRNA干扰(P)RR同时加入SB203580组,即siRNA(+)+SB203580组。2.Westernblot方法检测p-p38及Caspase-3蛋白表达量。3.应用ELISA方法检测H9c2心肌细胞上清液中炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β的浓度。结果:1.Westernblot结果显示:siRNA干扰(P)RR或加用p38MAPK抑制剂SB203580均可使p-p38蛋白表达下调;siRNA干扰(P)RR联合p38阻断剂SB203580使p-p38蛋白表达进步下调,提示p38MAPK活化至少部分通过(P)RR介导。2.缺氧复氧致p38MAPK磷酸化水平增加,siRNA干扰(P)RR单独或联用p38阻断剂SB203580可部分抑制缺氧复氧所致的p-p38MAPK的蛋白表达的上调。3.siRNA干扰(P)RR单独或合并阻断p-p38MAPK使Caspase-3蛋白表达下调。4.siRNA干扰(P)RR单独或合并阻断p-p38MAPK使炎症因子IL-6、TNF-a、TGF-β分泌减少。结论:(P)RR通过激活p38MAPK信号通路部分介导缺氧复氧致H9c2心肌细胞凋亡及炎症反应。
【作者】刘岩;
【导师】姜一农;
【作者基本信息】大连医科大学,内科学,2014,博士
【关键词】肾素(前体)受体;H9c2心肌细胞;缺氧复氧;p38MAPK信号通路;细胞凋亡;炎症因子;

【参考文献】
[1]任静.接种菌剂对牛粪堆肥过程中微生物、酶活性及腐殖质的影响[D].甘肃农业大学,设施作物,2013,硕士.
[2]宋博.多智能体及其在板形控制中的应用研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[3]周海龙.嵌入式门禁系统的设计与实现[D].西安电子科技大学,软件工程,2012,硕士.
[4]李元权.英汉被动句结构与功能对比研究[D].南京师范大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[5]田林林.稀土掺杂NaLuF_4纳米晶上转换荧光特性及热效应研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2013,硕士.
[6]赵彦越.黑龙江省桦树皮制作技艺的数字化传播策略研究[D].哈尔滨工业大学,广播电视艺术学,2013,硕士.
[7]李晓坤.文革时期标语文字的现代设计意义[D].中央美术学院,视觉传达设计研究,2013,硕士.
[8]秦亚冰.头针配合体针治疗心脾两虚型抑郁症的临床观察[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学(专业学位),2013,硕士.
[9]许正兰.贵州民族文化传承“场域”研究[D].贵州民族大学,民族学,2012,硕士.
[10]杜佳珺.永宁油田河川—永宁区块延8油层组储层特征及石油富集规律研究[D].长安大学,矿产普查与勘探,2014,硕士.
[11]戴佳君.企业战略纳税筹划研究[D].湖南大学,财政学,2003,硕士.
[12]杨芳.论民事诉讼法上诚实信用原则[D].安徽大学,法律,2003,硕士.
[13]陈倩.虚幻与现实之间[D].湖北大学,传播学,2011,硕士.
[14]张洪迎.中小型高科技公司治理特征与绩效研究[D].沈阳理工大学,企业管理,2012,硕士.
[15]李笑笑.新型无线通信网络中继协作技术研究[D].华侨大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[16]黄景涛.支持向量机算法参数选择及其在电站锅炉系统中的应用研究[D].浙江大学,2005.
[17]杨清鑫.抗糖尿病药物SGLT-2抑制剂的设计与合成研究[D].湖南中医药大学,药物化学,2013,硕士.
[18]林娜.硫酸软骨素降解产物及其结构的液质联用分析方法研究[D].浙江工商大学,食品工程(专业学位),2013,硕士.
[19]宋洋.针刺对MCAO大鼠内质网应激PKRK凋亡通路的影响[D].湖南中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[20]鲍军鹏,李鹏,刘晓东,沈钧毅.用数据挖掘方法扩充知识库的研究及应用[J].小型微型计算机系统,2004,04:621-624.
[21]张龙涛.一种基于QoS的自适应失效检测算法研究[D].郑州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[22]肖萌萌.中国OFDI的区位决定因素[D].山东大学,国际贸易学,2013,硕士.
[23]张瑞杰.马铃薯StCYP707As基因的克隆与功能分析[D].南京农业大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[24]刘祥林.雷达区域相关匹配技术及其在潘兴Ⅱ战术地地导弹末制导上的应用[J].飞航导弹.1989(05)
[25]李慧,戴汝为.在体生物光学成像技术的研究进展[J].自动化学报,2008,12:1449-1457.
[26]徐晓刚.高压差迷宫式多级降压调节阀内部流动特性分析研究[D].兰州理工大学,化工过程机械,2013,硕士.
[27]王春圣.热电变流器研究与设计[D].华东交通大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[28]何燦.《四庫全書》纂修中的校勘成就[D].山东大学,中國古典文獻學,2014,博士.
[29]揭志熹.基于Zigbee无线传感器网络的车辆定位方法[D].北京交通大学,2009.
[30]陈华宏.成都共享教育网络技术公司营销策略研究[D].西南交通大学,2004.
[31]万冀.商业银行对中小企业授信的风险管理研究[D].天津商业大学,金融学,2013,硕士.
[32]张海涛.雾凇宾馆管线改造项目施工现场安全管理研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[33]郝丽娜,徐心和.基于粗糙集理论的规则修正方法[J].控制与决策,2002,05:614-616+620.
[34]曹如中.技术创新与企业核心竞争力研究[D].湖南大学,科学技术哲学,2003,硕士.
[35]涂志刚.肛周脓肿致大面积急性坏死性筋膜炎及阴囊坏疽一例并文献复习[D].华中科技大学,急诊医学,2013,硕士.
[36]郜莉.苏州缂丝的现代传承与发展研究[D].苏州大学,设计艺术学,2014,硕士.
[37]骆盼育.正交放置平屋盖的风致干扰效应研究[D].北京交通大学,2014.
[38]江小川.构建我国巨灾保险体系的研究[D].浙江工商大学,保险,2013,硕士.
[39]王金洋.车载式道路破损自动识别系统[D].长安大学,车辆工程,2014,硕士.
[40]梁琼.基于AC模型的汉语歇后语认知识解机制研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[41]谢丽君.语用能力测试中评卷人效应的研究[D].广东外语外贸大学,外语教学技术与评估,2013,硕士.
[42]郭军.鄂尔多斯盆地镇泾探区长9油层组储层特征研究[D].成都理工大学,地质学,2013,硕士.
[43]隋明锐.阿什河哈尔滨段水质模拟与纳污能力核算的研究[D].哈尔滨工业大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[44]尚广云,梁晓静,王耀辉,温桂清,罗杨合,梁爱惠,蒋治良.肼还原制备红色纳米银胶及其光谱特性研究[A].中国光学学会、中国化学会.第十八届全国分子光谱学学术会议论文集[C].中国光学学会、中国化学会:,2014:2.
[45]鞠文尧.论不公平合同条款修补的最小容忍原则[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[46]赵平歌1,2,周孝德1,刘睿1,逯延军2.西安黑河流域水体细菌群落分布调查与研究1[J].环境保护科学,2014,06:.
[47]徐泰林.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类零价最小剩余相位误差环[J].电讯技术.1992(01)
[48]孔美丹.我国邪教组织犯罪规制完善研究[D].贵州民族大学,刑法学,2014,硕士.
[49]杨洋,马玉祥.基于关联规则的网管告警数据库知识发现[J].微电子学与计算机,2004,01:48-51.
[50]乔凤英.生态脆弱的资源型地区集体林权制度改革研究[D].华中师范大学,政治学理论,2012,硕士.

相关推荐
更多