AT2受体在脑缺血再灌注中的作用及其机制的研究

【摘要】目的：脑缺血再灌注损伤（cerebralischemiareperfusioninjury，CIRI）是指缺血脑组织重新获得血供后，脑细胞功能代谢障碍及结构破坏进一步加重的现象，是由多种机制参与的可引起一系列细胞、分子及其调节过程变化的复杂的病理生理过程。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin,AngⅡ)是肾素血管紧张素醛固酮系统(reninangiotensinaldosteronesystem,RAAS)一种重要的多功能血管活性物质,可作用于特异的膜结合受体上，目前所知的RAAS的生物效应几乎均通过AngⅡ与相应的受体作用，其受体分为AngⅡ1型受体(AT1受体)和AngⅡ2型受体(AT2受体)两种。在许多情况下,AngⅡ与AT2受体结合和AngⅡ与AT1受体结合所介导的生物学效应及信号转导通路具有拮抗作用，如增殖/抗增殖,细胞分裂/分化和凋亡,血管收缩/舒张。在未成熟的大脑，AT2受体表达丰富且分布广泛，主要集中在与运动、感觉、学习相关的中枢区域及边缘系统的某些结构,但在成年大鼠中,这些部位的AT2受体显著减少。既往研究表明，在神经组织内AT2受体可以促进细胞的分化和再生，从而促进神经功能的恢复。本研究首先建立大鼠大脑中动脉闭塞（middlecarotidarteryocclusion，MCAO）模型，观察脑缺血再灌注损伤后脑组织中AT2受体的表达情况及相关因子的变化，探讨AT2受体在脑缺血再灌注损伤中的作用及其可能的机制，并进一步探讨坎地沙坦(Candesartan)对脑缺血再灌注损伤的影响和可能的机制，从而为脑缺血再灌注损伤提供新的治疗方向和理论依据。实验方法：1.建立MCAO模型。2.TTC染色检测脑梗死体积。3.免疫组化法检测脑组织AT2受体、IL1β、TNFα、IL10、cfos、cjun及大脑中动脉PCNA、αSMactin的表达。4.HE染色检测大脑中动脉横断面内膜、中膜面积并做内膜与中膜面积比。5.RealtimePCR检测脑组织Bcl2mRNA、BaxmRNA的表达。6.Westernblot检测脑组织Bcl2、Bax蛋白的表达。7.统计学处理：采用SPSS11.5软件进行统计学分析，所有数据以均值±标准差表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果：1.免疫组化法检测AT2受体表达变化说明AT2受体参与了脑缺血再灌注过程：再灌注1天时脑组织中AT2受体表达量开始上升（P＜0.05），于第7天达高峰，第10天表达量逐渐下降。2.免疫组化法检测IL1β、TNFα和IL10表达变化说明免疫炎症反应参与了脑缺血再灌注过程：与sham组比较，I/R组脑组织中IL-1β表达增加（P＜0.05），TNF-α表达增加（P＜0.05），IL-10表达增加（P＜0.05）。3.免疫组化法检测大脑中动脉PCNA和αSMactin表达变化，HE染色检测大脑中动脉横断面内膜、中膜面积并做内膜与中膜面积比（I/M）说明脑缺血再灌注可引起缺血动脉内膜增生，进而导致血运重建后血管狭窄的发生：与sham组比较，I/R组缺血侧大脑中动脉PCNA表达增加（P＜0.05），α-SM-actin表达减少（P＜0.05）；I/R组缺血侧大脑中动脉横截面的I/M值增大（P＜0.05）。4.免疫组化法检测cfos、cjun表达变化，RTPCR检测Bcl2mRNA、BaxmRNA及Westernblot检测Bcl2、Bax蛋白的表达变化说明细胞凋亡参与了脑缺血再灌注过程：与sham组比较，I/R组脑组织中Bcl-2mRNA的相对表达量减少（P＜0.05），BaxmRNA的相对表达量增多（P＜0.05）；Bcl-2蛋白的相对表达量减少（P＜0.05），Bax蛋白的相对表达量增多（P＜0.05）；c-fos表达增加（P＜0.05），c-jun表达增加（P＜0.05）。5.免疫组化法检测不同组AT2受体表达变化及TTC染色检测脑梗死体积说明AT2受体在脑缺血再灌注过程中起保护作用：给予CGP42112处理后脑组织中AT2受体表达量增加（*P＜0.05vs.Control组），给予PD123319处理后脑组织中AT2受体表达量减少（#P＜0.05vs.Control组）；给予CGP42112处理后脑梗死体积缩小（*P＜0.05vs.Control组）；给予PD123319处理后脑梗死体积扩大（#P＜0.05vs.Control组）。6.免疫组化法检测不同组IL1β、TNFα和IL10表达变化说明再灌注损伤后AT2受体通过抑制免疫炎症反应起神经保护作用：给予CGP42112处理后脑组织中IL-1β表达减少（*P＜0.05vs.Control组），TNF-α表达减少（*P＜0.05vs.Control组），IL-10表达增加（*P＜0.05vs.Control组）；给予PD123319处理后脑组织中IL-1β表达增加（#P＜0.05vs.Control组），TNF-α表达增加（#P＜0.05vs.Control组），IL-10表达减少（#P＜0.05vs.Control组）。7.免疫组化法检测不同组大脑中动脉PCNA和αSMactin表达变化，HE染色检测大脑中动脉横断面的内膜、中膜面积并做内膜与中膜面积比（I/M）说明再灌注损伤后AT2受体通过抑制血运重建后血管狭窄的发生起神经保护作用：给予CGP42112处理后，缺血侧大脑中动脉PCNA表达减少（*P＜0.05vs.Control组），α-SM-actin表达增加（*P＜0.05vs.Control组），给予PD123319处理后缺血侧大脑中动脉PCNA表达增加（#P＜0.05vs.Control组），α-SM-actin表达减少（#P＜0.05vs.Control组）；给予CGP42112处理后动脉横截面的I/M值减小（*P＜0.05vs.Control组）；给予PD123319处理后动脉横截面的I/M值增大（#P＜0.05vs.Control组）。8.免疫组化法检测不同组cfos、cjun表达变化，RTPCR检测Bcl2mRNA、BaxmRNA及Westernblot检测Bcl2、Bax蛋白的表达变化说明再灌注损伤后AT2受体通过抑制神经细胞的凋亡起神经保护作用：给予CGP42112处理后脑组织中Bcl-2mRNA的相对表达量增加（*P＜0.05vs.Control组），BaxmRNA的相对表达量减少（*P＜0.05vs.Control组），给予PD123319处理后脑组织中Bcl-2mRNA的相对表达量减少（#P＜0.05vs.Control组），BaxmRNA的相对表达量增加（#P＜0.05vs.Control组）；给予CGP42112处理后脑组织中Bcl-2蛋白的相对表达量增加（#P＜0.05vs.Control组），Bax蛋白的相对表达量减少（#P＜0.05vs.Control组）；给予PD123319处理后脑组织中Bcl-2蛋白的相对表达量减少（*P＜0.05vs.Control组），Bax蛋白的相对表达量增加（*P＜0.05vs.Control组）。9.免疫组化法检测不同组AT2受体表达变化及TTC染色检测脑梗死体积说明再灌注损伤后Candesartan可通过促进AT2受体的表达起神经保护作用：给予Candesartan处理后脑组织中AT2受体表达量增加（P＜0.05）；脑梗死体积缩小（P＜0.05）。结论：1.脑缺血再灌注后，脑组织AT2受体表达增加。2.脑缺血再灌注损伤可诱发脑组织内免疫炎症反应、血液重建后缺血动脉狭窄及神经细胞凋亡。3.AT2受体在脑缺血再灌注过程中起保护作用，这种保护作用可能通过抑制免疫炎症反应、血运重建后血管狭窄的发生及神经细胞的凋亡而实现。4.Candesartan在脑缺血再灌注过程中起保护作用，这种保护作用可能是通过促进AT2受体在再灌注脑组织中的表达，进而促进AT2受体所介导的神经保护作用而实现。
【作者】马春野；
【导师】尹琳；
【作者基本信息】大连医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】脑缺血再灌注；AT2受体；免疫因子；VSMC凋亡基因；坎地沙坦；

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