AMPA受体外化在铝致大鼠海马LTP损害中的作用及其信号转导机制研究

【摘要】第一部分：急性、亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP损害作用及对AMPA受体外化的影响从本课题组的前期研究结果发现，在亚慢性染铝致大鼠学习记忆损害的动物模型中，海马细胞内AMPA受体亚单位的表达量降低，说明AMPA受体与铝损害学习记忆的机制有关。同时AMPA受体作为LTP的主要表达机制，我们有理由认为AMPA受体可能是铝损害LTP机制之一。所以，本项目拟通过急性和亚慢性铝暴露，观察不同剂量铝对大鼠海马LTP的影响，以及在损害LTP的情况下，AMPA受体外化（AMPA受体亚基GluR1、GluR2分别在胞膜和总蛋白中蛋白表达量）的改变，为阐明铝损害LTP的机制研究提供有力的实验依据。第一章急性铝暴露对大鼠海马LTP的影响目的：探讨急性铝暴露对大鼠海马LTP的影响。方法：对照组、低、中、高染铝组大鼠通过侧脑室给药的方式分别一次性接受生理盐水、2.43μgAl(mal)3、12.15μgAl(mal)3和60.75μugAl(mal)3，给药容积为5μl，5min内缓慢匀速注入。采用在体海马CA1区LTP及PPF记录技术，记录fEPSP。结果：各个剂量组在给药前和给药后5min、15min、30min的fEPSP幅度变化不大，无统计学差异(P>0.05)；侧脑室内注射生理盐水及不同剂量Al(mal)3后不影响PPF，与注射前相比没有显著性差异(P>0.05)，Al(mal)3未对突触前释放产生影响；对照组在高频刺激后fEPSP即刻增大至（221±10）%，1h后仍保持在（190±27）%，但注射了Al(mal)3的中高剂量组在在高频刺激后fEPSP即刻增大的幅度仅为（165±21）%和（149±8）%，在1h之后，中剂量组fEPSP幅度仅保持在（140±13）%，高剂量组fEPSP幅度几乎回到了高频刺激前的基础水平（110±7）%，与对照组组比显著降低（P<0.05），低剂量组虽然在高频刺激后fEPSP即刻增大的幅度达到了（194±19）%，与对照组无差别(P>0.05)，但在30min及1h后，幅度降低到了（164±13）%和（157±8）%，比对照组明显降低，由此可见，Al(mal)3对LTP的诱导与维持的抑制成明显的剂量依赖性。结论：Al(mal)3对LTP的诱导与维持的有明显的抑制作用，并呈现出显著的剂量依赖性，这可能与铝损害突触后机制（如，NMDAR、AMPAR等谷氨酸受体）有关。第二章急性铝暴露对大鼠海马AMPA受体外化的影响目的：探讨急性铝暴露对海马AMPA受体外化的影响。方法：对照组、低、中、高染铝组大鼠通过侧脑室给药的方式分别一次性接受生理盐水、2.43μgAl(mal)3、12.15μgAl(mal)3和60.75ugAl(mal)3，给药容积为5μl，5min内缓慢匀速注入。在电生理实验结束后断头取海马，分别提取总蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法检测AMPA受体亚单位GluR-1、GluR-2的蛋白表达水平。结果：总蛋白中，低、中、高染铝组上述两种亚单位的蛋白表达量无变化，且与对照组相比，无统计学差异（P>0.05）；膜蛋白中，低、中、高染铝组上述两种亚单位的蛋白表达量呈逐下降的趋势，且与对照组相比，有统计学差异（P<0.05）。结论：急性铝暴露未影响AMPA受体的蛋白合成，但抑制了AMPA受体从胞浆向胞膜的转运（外化）。第三章亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP的影响目的：探讨亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组：生理盐水、低剂量组Al(mal)3（0.41mg/kg）、中剂量组Al(mal)3（0.82mg/kg）与高剂量组Al(mal)3（1.23mg/kg），腹腔注射染毒8周后，采用在体海马CA1区LTP记录技术，记录fEPSP。结果：对照组在高频刺激后fEPSP即刻增大至（191±9）%，30min时保持在（154±15）%，60min后降低到（139±12）%；低剂量组fEPSP幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为（195±17）%、（153±21）%和（131±18）%，与对照组比较，无统计学差异（P>0.05）；中剂量组fEPSP幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为（176±21）%、（132±20）%和（117±7）%，与对照组比较，30min、60min时的幅度有统计学差异（P<0.05），与低剂量组比较30min时的幅度有统计学差异（P<0.05）；高剂量组fEPSP幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为（175±40）%、（106±5）%和（85±10）%，与对照组比较，30min、60min时的幅度有统计学差异（P<0.05），与低剂量组比较30min、60min时的幅度有统计学差异（P<0.05），与中剂量组比较30min、60min时的幅度有统计学差异（P<0.05）。结论：亚慢性铝暴露对大鼠海马CA1区LTP呈显著的抑制作用，并成一定的剂量依赖性。第四章亚慢性铝暴露对大鼠海马AMPA受体蛋白外化的影响目的：探讨亚慢性铝暴露对海马AMPA受体外化的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组：生理盐水、低剂量组Al(mal)3（0.41mg/kg）、中剂量组Al(mal)3（0.82mg/kg）与高剂量组Al(mal)3（1.23mg/kg），腹腔注射染毒8周，在电生理实验结束后断头取海马，分别提取总蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法检测AMPA受体亚单位GluR-1、GluR-2的蛋白表达水平。结果：总蛋白中，高剂量组GluR-1蛋白表达量且与对照组相比，显著降低（P<0.05），中、高剂量组的GluR-2蛋白表达量与对照组比较明显降低（P<0.05），且高剂量组的GluR-2蛋白表达量与低剂量组相比降低明显（P<0.05）；膜蛋白中，两种亚单位的蛋白表达量随着染毒剂量的增加呈逐渐下降的趋势，中、高剂量组GluR-1、GluR-2蛋白表达量且与其对照组相比，显著降低（P<0.05），且高剂量组的GluR-1蛋白表达量与低剂量组相比降低明显（P<0.05）。结论：亚慢性铝暴露不但抑制了AMPA受体从胞浆向胞膜的转运（外化），而且也抑制了AMPA受体的合成。第二部分铝损害AMPA受体外化的信号转导机制研究从本文第一部分的研究结果来看，AMPA受体参与铝损害大鼠海马LTP的发生机制，而其信号转导机制还不清楚。本部分研究拟采用在体电生理技术、western-blot和ELISA方法观察在急性铝暴露的情况下，伴随LTP损害情况下，RAS、MAPK、PI3K通路各个信号分子的表达情况，以及使用RAS活化剂的情况下，LTP及各个信号分子的变化。通过此次研究初步阐明AMPA受体外化在铝损害大鼠海马LTP中的作用及其信号转导机制，为铝致学习记忆损伤的机制研究及未来的干预研究提供有力的依据。第一章RAS在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究第一节急性铝暴露对大鼠海马RAS活性的影响目的：探讨急性铝暴露对大鼠海马RAS蛋白活性的影响。方法：对照组、低、中、高染铝组大鼠通过侧脑室给药的方式分别一次性接受生理盐水、2.43μgAl(mal)3、12.15μgAl(mal)3和60.75μgAl(mal)3，给药容积为5μl，5min内缓慢匀速注入。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定RAS蛋白活性。结果：随着染铝剂量的增加，RAS活性呈逐渐下降的趋势，经统计学分析，与对照组比较，中、高剂量组的RAS活性显著下降（P<0.05）。结论：急性铝暴露会抑制RAS蛋白的活性，RAS活性的降低可能与铝损害LTP有密切关系。第二节RAS活化剂EGF在铝致大鼠LTP损害中的拮抗作用研究目的：探讨RAS活化剂EGF在铝致大鼠LTP损害的拮抗作用。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组：对照组（生理盐水）、EGF组.、Al+EGF组与Al组。采用侧脑室注射的方式一次性给予对照组大鼠5μl生理盐水，给予EGF组大鼠60ngEGF，给予Al+EGF组大鼠12.15μgAl和60ngEGF，给予Al组大鼠12.15μgAl。采用在体海马CA1区LTP记录技术，记录fEPSP。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定RAS蛋白活性。结果：高频刺激后，对照组fEPSP幅度立即升高到（191±25）%，30min时保持在（179±22）%，60min后仍能保持在（156±27）%，而单纯染铝组fEPSP幅度在1min时为（160±4）%，在30min时持续下降到（132±15）%，而到60min时已完全恢复致基线水平（115±12）%，说明12.15ugAl显著的抑制了LTP的诱导和维持，这与我们第一部分第一章的结果相一致。EGF作为RAS的活化剂，我们在观察它是否会拮抗Al对LTP的抑制作用之前，我们首先观察了单独使用EGF是否会引起LTP的变化。结果显示，60ngEGF组高频刺激后fEPSP幅度在1min、20min时分别是（224±28）%和（189±14）%，与对照组比较幅度升高很明显（P<0.05），但到了30min、40min、60min时，fEPSP幅度与对照组一致，无明显差别（P>0.05）。此结果显示，EGF可以增强早期的LTP诱导，但到了后期作用减弱。最后我们联合使用了12.15ugAl和60ngEGF，结果我们惊喜的发现，EGF可以拮抗Al导致的LTP损害，在高频刺激后的1min、20min时，12.15ugAl+60ngEGF组fEPSP幅度分别为（183±5）%和（158±15）%，与单独使用12.15ugAl组比较，有了明显的上升（P<0.05），但到了30min、40min、60min时，fEPSP幅度与12.15ugAl组一致，无明显差别（P>0.05）。此结果说明EGF可以拮抗Al对LTP诱导的早期损害，但到了后期，这种拮抗作用减弱。结论：RAS活化剂的EGF可以拮抗急性铝暴露致LTP早期损害作用，急性铝暴露致大鼠海马LTP损害与RAS蛋白活性降低有关。第二章PI3K/PKB通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究目的：探讨PI3K/PKB通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组：对照组（生理盐水）、EGF组.、Al+EGF组与Al组。采用侧脑室注射的方式一次性给予对照组大鼠5μl生理盐水，给予EGF组大鼠60ngEGF，给予Al+EGF组大鼠12.15μgAl和60ngEGF，给予Al组大鼠12.15ugAl。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定PKB蛋白活性，采用western-blot法测定GluR1S831和S845位点磷酸化水平。结果：与对照组比较，单独给予12.15μgAl后，PKB活性明显下降（P<0.05），单独给予60ngEGF后，PKB活性明显升高（P<0.05），当联合给予12.15μgAl和60ngEGF后，与单独染铝组相比，PKB活性又有明显的回升（P<0.05）；与对照组比较，单独给予12.15μgAl后，GluR1S831和S845位点磷酸化水平明显下降（P<0.05），单独给予60ngEGF后，其磷酸化水平明显升高（P<0.05），当联合给予12.15μgAl和60ngEGF后，与单独染铝组相比，其磷酸化水平又有明显的回升（P<0.05）。结论：铝可能通过RAS-PI3K信号转导通路致AMPA受体磷酸化障碍，进而影响AMPA受体外化，最终表现出LTP的诱导受到抑制。第三章MAPK/ERK通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究目的：探讨MAPK/ERK通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组：对照组（生理盐水）、EGF组.、Al+EGF组与Al组。采用侧脑室注射的方式一次性给予对照组大鼠5ul生理盐水，给予EGF组大鼠60ngEGF，给予Al+EGF组大鼠12.15μgAl和60ngEGF，给予Al组大鼠12.15μgAl。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定ERK蛋白活性。结果：与对照组比较，单独给予12.15μgAl后，ERK活性明显下降（P<0.05），单独给予60ngEGF后，ERK活性明显升高（P<0.05），当联合给予12.15μgAl和60ngEGF后，与单独染铝组相比，ERK活性又有明显的回升（P<0.05）。结论：铝可抑制RAS-MAPK信号转导通路。但由于未检测GluR2LS841的磷酸化水平，所以还不能确定RAS-MAPK信号转导通路是否可致AMPA受体磷酸化障碍，从而导致LTP受到抑制。结论：急性及亚慢性铝暴露均会损害大鼠海马LTP的诱导和维持，这种损害的程度与铝的剂量有关，即呈现一定的剂量反应关系。铝通过抑制AMPA受体亚单位的外化及合成从而损害大鼠海马LTP的诱导和维持。“RAS→PI3K/PKB→GluR1S831和S845位点磷酸化→GluR1插入突触”通路与铝损害大鼠海马LTP有关。RAS→MAPK/ERK信号转导通路与铝损害大鼠海马LTP有关，但是否是通过引起AMPA受体磷酸化异常进而影响AMPA受体外化最终导致LTP损害的还有待于进一步研究。
【作者】宋静；
【导师】牛侨；
【作者基本信息】山西医科大学，劳动卫生与环境卫生学，2014，博士
【关键词】麦芽酚铝；长时程增强；AMPA受体；RAS蛋白；PKB；ERK；GluR1S831；GluR1S845；

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