日本血吸虫体被蛋白质组学研究

【摘要】日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。体被是血吸虫和宿主物质交换的场所，也是宿主免疫效应分子与虫体直接接触的界面，与血吸虫营养摄取、信号传导和免疫逃避等密切相关。一些体被表膜蛋白，特别是期别和性别差异表达体被表膜蛋白对维持血吸虫在终末宿主体内寄生及完成其生活史至关重要。开展日本血吸虫体被表膜蛋白质的组成和变化分析，及体被蛋白质组的免疫学筛选，鉴定与日本血吸虫生长发育相关的重要分子，及免疫相关分子，可为阐述血吸虫与宿主的相互作用机制提供重要信息，为疫苗候选分子、新治疗药物靶标和诊断抗原分子的筛选提供新思路，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。1．日本血吸虫童虫与成虫体被表膜蛋白质组分析血吸虫的生活史复杂，在不同发育阶段表现出不同的生物学和形态学特征。童虫和成虫体被表膜上差异表达的蛋白，对血吸虫的存活、生长和繁殖具有重要意义。本研究应用非渗透性生物素sulfo-NHS-SS-biotin标记14d童虫和32d成虫的体被表膜蛋白，利用链酶亲和素-生物素系统纯化获得生物素标记蛋白，随后利用液相色谱串联质谱法进行高通量蛋白质组学分析。结果显示，童虫和成虫分别鉴定到了245个和103个蛋白分子，包括59个共有的蛋白，186个童虫高表达的蛋白，及44个成虫高表达的蛋白。90%的差异表达体被表膜蛋白的理论相对分子量为10-70kDa，等电点为4-10。GO分析显示，童虫高表达蛋白主要与RNA代谢过程，基因表达，大分子生物合成过程，RNA结合等相关。而成虫高表达蛋白主要与中性粒细胞凋亡过程的调节，过氧化氢分解代谢过程，丝氨酸型肽酶活性等相关。本研究为揭示血吸虫在终末宿主体内的生长发育机制提供重要信息，为筛选血吸虫疫苗候选分子、药物靶标以及诊断抗原分子提供新思路。2．日本血吸虫雌雄虫体被表膜蛋白质组分析雌雄虫之间的相互作用是雌虫发育成熟以及产卵的先决条件，也与血吸虫的致病和传播有着紧密联系。一些雌雄虫差异表达蛋白在虫体与宿主的相互作用中具有重要的作用。本研究利用链霉菌亲和素-生物素亲和纯化技术以及液相色谱-质谱/质谱联用技术分析了日本血吸虫雌、雄虫体被表膜蛋白质组，二者分别鉴定到了179个和300个蛋白分子，包括119个雌雄虫共有的，60个雌虫高表达的，和181个雄虫高表达的蛋白。生物信息学分析表明，在这些被鉴定的体被表膜蛋白中，有的参与到了血吸虫与宿主的相互作用中，如serpin和CD36-likeclassBscavengerreceptor，有的与雌雄虫之间的相互作用有关，如gynecophoralcanalprotein。GO分析显示，雌虫高表达蛋白主要与蛋白质糖基化和溶酶体功能等相关，而雄虫高表达蛋白主要与细胞内信号转导、丝状肌动蛋白聚合作用的调控、蛋白酶体复合物功能等相关。该研究结果为分析明确雌雄虫在生理学上的差异及更好地理解雌雄虫相互作用和性成熟机制提供重要的实验依据，同时也可为抗血吸虫病疫苗候选分子和药物靶标的筛选提供基础。3．基于体被抗原免疫蛋白质组学的日本血吸虫病诊断抗原的筛选及应用价值评估由于体被直接暴露于宿主内环境，一些体被抗原分子成为刺激、诱导宿主产生特异性免疫应答的重要分子。本研究以日本吸虫体被蛋白作为抗原，以日本血吸虫感染前，感染后的2周和6周，以及吡喹酮治疗后1，2，3，4，5，6，7，8月的兔血清为一抗，利用免疫蛋白质组学技术筛选具有免疫诊断价值的抗原分子。研究结果显示，有10个蛋白点未被感染前兔血清识别，但在感染后的第2周和6周都呈阳性反应，而在治疗后的早期阶段又转为阴性反应。经质谱鉴定，这10个蛋白点分属于6个不同蛋白质。我们从中挑选磷酸甘油酸酯变位酶（Phosphoglyceratemutase，PGM）进行了克隆、表达。经免疫组织定位分析表明SjPGM为一体被蛋白。ELISA法分析结果显示，实验兔感染日本血吸虫2周后，所有兔子都可检测出抗rSjPGM和SEA的特异性抗体。在吡喹酮治疗后的第2月至第7月，以rSjPGM作为诊断抗原，所有实验兔都陆续转为阴性，而直至吡喹酮治疗后第8月，以SjSEA作为诊断抗原，所有实验兔仍都呈阳性。表明在考核药物疗效，或区分现症感染和既往感染方面，rSjPGM作为诊断抗原要明显优于目前最常用的SjSEA。进一步应用ELISA法检测了104份血吸虫感染阳性水牛血清和60份健康水牛血清，结果以rSjPGM和SjSEA作为诊断抗原，其敏感性分别为91.35%和100.00%，特异性分别为100.00%和91.67%。而在检测14份前后盘吸虫、9份大片吸虫感染水牛血清时，rSjPGM的交叉反应率为7.14%和11.11%，SjSEA为50.00%和44.44%，表明rSjPGM作为牛血吸虫病的诊断抗原具有潜在的应用价值。4．日本血吸虫SjCHMP5的克隆、表达及rSjCHMP5诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价在前期体被蛋白质组学研究的基础上，挑选出一体被蛋白带电多泡体蛋白5（Chargedmultivesicularbodyprotein5，CHMP5）进行克隆、表达、生物学特性分析及重组蛋白诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价。利用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中克隆到了编码SjCHMP5（GenBankaccessionno.FN320038）的ORF序列，该序列含675bp，编码224个氨基酸，其理论等电点和分子量分别为4.49及25kDa。构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-SjCHMP5，在大肠杆菌系统中成功获得表达，重组蛋白rSjCHMP5以可溶性蛋白形式存在，其理论分子量约为29kDa。质谱鉴定结果表明，检测的纯化重组蛋白确实为rSjCHMP5。Westernblotting分析表明，rSjCHMP5具有较好的抗原性。免疫荧光染色试验分析显示，SjCHMP5主要定位于日本血吸虫虫体的体被上，为一体被蛋白。应用纯化的rSjCHMP5结合206佐剂免疫BALB/c小鼠，与佐剂对照组相比，诱导了18.96%的减虫率（P<0.05）和42.98%的肝脏减卵率（P<0.01）。ELISA试验表明，重组蛋白二次免疫后针对rSjCHMP5的特异性IgG抗体滴度即达到较高水平。本研究表明rSjCHMP5可诱导小鼠产生部分的抗血吸虫病的免疫保护效果。综上，本研究首次应用生物素链酶亲和素系统分离纯化了日本血吸虫童虫、成虫以及雌雄虫体被表膜蛋白，应用Shotgun技术和生物信息学技术系统分析其组成和变化。同时，首次应用免疫蛋白组学技术，比较分析血吸虫感染前、感染后以及经吡喹酮治疗后不同时期具有免疫原性的血吸虫成虫体被抗原的变化情况。筛选出一个具有血吸虫病诊断价值的抗原分子SjPGM。首次对日本血吸虫体被蛋白SjCHMP5编码基因进行了克隆、表达及生物学特性分析，评估了其重组蛋白在小鼠体内诱导的抗血吸虫感染的免疫保护效果。研究成果为鉴定血吸虫与宿主相互作用的关键分子、阐述日本血吸虫的生长发育机制提供了有价值的信息，为抗血吸虫病疫苗候选分子、新药物靶标和新诊断抗原分子的筛选提供了新思路，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。
【作者】张旻；
【导师】林矫矫；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】日本血吸虫；体被蛋白；蛋白质组学；SjPGM；SjCHMP5；

【参考文献】
[1]宋洋.银屑病合并天疱疮7例临床分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[2]程莹.地下管线非开挖施工中导向钻杆应力分析[D].郑州大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[3]谢红.论音乐作品创造历程中的“情、音、象”[D].河北大学,艺术学,2002,硕士.
[4]张庆.鄂尔多斯盆地富黄探区长6段储层特征与油气藏分布关系研究[D].西北大学,油气田地质与开发,2013,博士.
[5]谢海英.成都市自来水六厂氯胺消毒运行方式研究[D].重庆大学,环境工程,2003,硕士.
[6]王婉萍.大学生创业教育及保障体系的研究[D].浙江大学,2006.
[7]谷延超.机载激光雷达点云数据滤波方法研究[D].西南交通大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[8]陈露.活血化瘀法辨治中重度癌痛的临床研究[D].广州中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[9]王昆.超声钎焊中温升过程的数值模拟及实验研究[D].哈尔滨工业大学,材料工程,2013,硕士.
[10]赵润泽.明代明刑弼教法律思想研究[D].云南财经大学,法学理论,2013,硕士.
[11]吴浩洋.COBOL-2002集成开发环境[D].西北工业大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[12]宋盈.新疆企业商业模式创新研究[D].新疆财经大学,企业管理,2013,硕士.
[13]刘忠,李立军,朱虹.县域农业生态分析评价决策支持系统的构建[J].中国农业科技导报,2003,01:18-21.
[14]陈晓文.论知识产权的海关保护[D].对外经济贸易大学,法律,2004,硕士.
[15]金晓菲.中国城乡住房保障差异及解决路径研究[D].山东财经大学,社会保障,2013,硕士.
[16]姚建国,高宗和,杨志宏,李斌,崔恒志.EMS应用软件支撑环境设计与功能整合[J].电力系统自动化,2006,04:49-53.
[17]于荟,朱银华,刘畅,杨祝红,陆小华,冯新.新型介孔SO_4~(2-)/TiO_2固体酸的制备及其催化酯化性能[J].催化学报,2009,03:265-271.
[18]潘登.大鹏半岛安全文化建设研究[D].华南理工大学,工业工程,2012,硕士.
[19]李题印,王强钢,吴健雄,周念成.面向余杭城区电网的环形微网及其并网同步控制[J].电力系统自动化,2012,18:97-102.
[20]张秀婷.聚丙烯酰胺在大庆土壤中吸附与迁移规律的研究[D].东北石油大学,化学工艺,2013,硕士.
[21]王学伟,瞿海斌,王阶.一种基于数据挖掘的中医定量诊断方法[J].北京中医药大学学报,2005,01:4-7.
[22]张荣芬.中美影子银行监管的比较研究[D].山东财经大学,金融学,2014,硕士.
[23]舒冠凤.毛泽东群众路线思想对社会管理创新的启示[D].曲阜师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[24]姜基建.斜交箱梁桥受力特性分析及实用计算方法研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[25]张钦斐.基于“营改增”的物流业涉税分析[D].山东财经大学,税务（专业学位）,2014,硕士.
[26]施莉.中小学校校本教师培训研究[D].浙江师范大学,2003.
[27]卢佳.一维复杂光栅热辐射特性计算研究[D].华中科技大学,热能工程,2012,硕士.
[28]陈诚.北京市综合运输货运系统协调性研究[D].北京交通大学,运输与物流,2013,硕士.
[29]刘一涛,党明,高彦芳,谢续明.铜离子配位的碳纳米管/石墨烯杂化网络填料对聚合物基体电学及力学性能的显著增强效果[A].中国化学会高分子学科委员会.2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C].中国化学会高分子学科委员会:,2011:1.
[30]范秀丽.ALDH1作为卵巢癌干细胞标志物的实验研究[D].吉林大学,内科学,2013,硕士.
[31]于丽.新课程前后高考数学函数部分的比较研究[D].鲁东大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[32]AnandGungadin（阿南）.The Value of Whole Body~(18)F-FDG PET/CT Imaging in Cytologically Proven Metastatic Cervical Carcinoma of Unknown Primary (CCUP): a Retrospective Study[D].华中科技大学,影像医学和核医学,2013,硕士.
[33]王振全.城市危险化学品物流配送网络可靠性研究[D].东北大学,安全技术及工程,2010,硕士.
[34]刘凡凡.SMS结构光纤温度传感器[D].浙江大学,光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[35]陈汝轩.IBDP地理学科评估方式对学生能力培养的影响研究[D].山东师范大学,学科教学论,2003,硕士.
[36]王荣.中国家用热水设备典型用水模式研究[D].北京建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[37]于益俊.数据仓库技术在金财工程中的研究和实现[D].南京航空航天大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[38]刘绪,张华玲,常少健,张磊,刘念.白酒酿造中稻壳功能的探讨[J].酿酒科技.
[39]梁远学.椰肉发育过程中差异表达基因的分离和功能注释[D].海南大学,生物化工,2014,硕士.
[40]李云飞.试论“大调解”机制下法院调解的完善[D].内蒙古大学,法律,2013,硕士.
[41]马岩.汽车用碳/芳纶纤维增强复合材料管件物的成型以及能量吸收机理的研究[D].东华大学,纺织材料与纺织品设计,2014,硕士.
[42]徐吟川.我国商业银行信用风险内部评估体系研究[D].华东师范大学,国际金融,2004,硕士.
[43]吴建厂.论人在信息依赖中的异化及其扬弃[D].苏州大学,马克思主义哲学,2003,硕士.
[44]方丽娟.我国案例指导制度研究[D].云南财经大学,法学理论,2013,硕士.
[45]本报记者易鹤通讯员陈梓军张彩娜.万众创新争发展[N].宁波日报,2014-12-19001.
[46]荣莉莉,王众托.利用模糊神经网络实现数值信息与语言信息的融合[J].控制与决策,2001,06:958-961.
[47]徐伟华.有限群极大子群的h-完备与θ-完备[D].广西大学,基础数学,2004,硕士.
[48]周丽娜,赵晗,魏东山,武永刚.锂掺杂多孔氧化石墨烯骨架储氢材料的合成[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第27分会：多孔功能材料[C].中国化学会:,2014:1.
[49]韩正之,刘建华,郑毅,张钟俊.非线性控制系统的特性（Ⅲ）[J].控制与决策,1994,06:471-478.
[50]武婧.债务契约要素能否抑制公司过度投资[D].内蒙古大学,工商管理,2014,硕士.