腰带长体茧蜂嗅觉相关蛋白基因的鉴定和功能验证

【摘要】嗅觉或者味觉是茧蜂信息交流的主要模式之一,并在探求配偶、定位寄主和产卵位点、躲避有害物质中发挥着重要的作用。茧蜂的嗅觉系统主要依靠化学感器发挥作用,化学感器中存在多种嗅觉相关蛋白,其中最主要的是气味结合蛋白(OBP)和嗅觉受体(OR)。为了研究腰带长体茧蜂Macrocentruscingulum的嗅觉分子机制,阐明其气味识别过程的化学感受途径,明确其嗅觉相关蛋白和信号转导机制,本文分别构建了腰带长体茧蜂雌雄虫触角的cDNA文库,获得了3160个功能基因,并利用GO分析、蛋白相邻类的聚簇分析(COG)、KEGG代谢途径分析对这些基因进行了基因注释。通过序列比对,我们鉴定出9个OR基因,3个IR基因和1个OBP基因,并利用荧光定量PCR技术研究了这些基因的组织表达谱(触角、去除触角的头部、胸部、腹部和足)。结果表明OR基因主要在触角中表,并且在雌虫中的表达量高于雄虫,而IR基因在各组织中都表达,并且在雄虫的表达量高于雌虫。本文克隆了腰带长体茧蜂的嗅觉受体McinOrco,通过序列比对发现该基因同其他已知昆虫的Orco有很高的同源性。利用荧光定量PCR技术分析McinOrco基因的表达谱,发现该基因主要在成虫触角中表达,但是在雌雄虫中的表达量有一定的差异。利用整体原位杂交技术可以直观的看出Orco基因在触角表达细胞的分布情况,结果显示Orco的表达感觉神经元在雄虫触角的39节中的表达量都非常丰富,Orco的表达细胞在触角的第20节的分布最为密集,在第7节的分布最少,雌虫中Orco表达细胞的分布水平低于雄虫。而几乎所有的表达细胞都分布于触角鞭节(40节)上,数量向近端逐渐减少。以上结果表明Orco的表达细胞的分布与昆虫的性别相关。本文在大肠杆菌Escherichiacoli在表达了McinOBPl,并通过镍柱亲和层析进行了纯化,荧光定量PCR实验结果表明McinOBPl主要在成虫触角中表达,在雌雄虫的表达水平不同。利用1-NPN作为荧光探针进行配基结合实验,结果表明McinOBP能够结合绿叶挥发物,除了能与醛类和萜类结合外,还能结合脂肪族醇类,结合顺序为反-2壬烯醛>顺-3-己烯-1-醇>反-caryophelle,暗示了McinOBP参与了普通气味的化学识别。除此之外,我们根据这3种化合物同McinOBPl的结合能力进行了同源建模,推测Va158,Leu62,Glu130是其气味识别过程中的关键氨基酸,因此分别以丙氨酸、脯氨酸和丙氨酸替代了第58、62、130位的缬氨酸、亮氨酸和谷氨酸,结果发现这3种突变体同这3种气味的结合能力有所下降,这表明Val58,Leu62,Glu130参与了这3种气味分子的识别过程,并通过形成氢键同这些气味分子结合。本文利用扫描电镜和透射电镜检测了腰带长体茧蜂触角感器和雌产卵器虫的外部形态和超微结构。腰带长体茧蜂雌雄虫的触角为丝状,长度为5.90-6.64mm,由柄节、梗节和鞭节(雄虫有39节鞭小节,雌虫有40节鞭小节)组成。通过电镜扫描可以明显鉴别到雌雄虫触角表皮的微孔及9种感受器,其中这九种感受器包括两种刺形感器(无孔)、毛形感器(无孔)、锥形感器Ⅰ型(无孔,钝形尖端)、锥形感器Ⅱ型(多孔)、锥形感器Ⅲ型(无孔,分枝的钝形尖端)、腔锥形感器(类似手指形状)、钟形感器(顶部中间具孔,盘状)、板形感器。通过比较这些感器在雌雄虫之间的数目、形态和分布,发现他们的形状和基本结构在雌雄虫中没有差异,但是雄虫触角的长度和宽度要显著大于雌虫触角,此外,雄虫触角中的板形感器要多于雌虫。3种类型的毛形感器在产卵器管鞘大量表达,Ⅱ型和Ⅲ型毛形感器主要集中在末梢,产卵器内表面被微毛覆盖,并且主要集中在尖端.腔锥形感器在腹产卵瓣和背侧产卵瓣都有分布,钟形感器和分泌气孔只存在于背产卵瓣处。我们推测类似滑动片的内部连锁机制连同腹侧和背侧产卵瓣尖端和腹侧产卵瓣孔在寄生、产卵和寄主选择过程中发挥重要作用。利用Y-型管分析腰带长体茧蜂对寄主植物的定位,结果表明玉米挥发物中的萜类、醛类和醇类物质单独或者共同发挥作用引诱腰带长体茧蜂。
【作者】TofaelAhmed；
【导师】王振营；
【作者基本信息】中国农业科学院，农业昆虫与害虫防治，2014，博士
【关键词】腰带长体茧蜂；嗅觉相关蛋白；结合测定；气味受体；化学感受器；Y-型管；

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