利用寄主诱导的基因沉默进行大丽轮枝菌致病力相关基因的研究

【摘要】棉花黄萎病（VerticilliumWiltofcotton）是一种土传、维管束系统性病害，被称为“棉花癌症”，给棉花的产量和棉纤维的质量都造成很大影响，其致病菌为大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）。由于大丽轮枝菌极易产生新的生理小种，给研究带来相当大的难度和很多的不确定性，因此对大丽轮枝菌的研究一直以来都是热点。本文采用寄主诱导的基因沉默技术（Host-inducedgenesilencing），以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，构建一系列针对大丽轮枝菌靶标基因的烟草脆裂病毒（tobaccorattlevirus，TRV）干扰载体。通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草（Nicotinabenthamiana），并进行大丽轮枝菌接种，统计病情指数以及抗性反应级，并通过分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平，期望筛选到病原菌致病与生长发育的关键基因。本研究的主要结果如下：1、根据已公布的大丽轮枝菌数据库中的蛋白质序列，按照生物学功能进行分类，大致分为能量代谢相关、蛋白质代谢相关、DNA复制相关以及RNA转录相关等12类；从每组中挑选5-10条序列作为靶标序列，构建92个TRV干扰载体，并转化至农杆菌GV3101；2、建立寄主诱导的基因沉默（Host-inducedgenesilencing，HIGS）体系并筛选候选基因。首先优化了农杆菌注射浓度以及病原菌接菌最佳时间。将构建的92个TRV干扰载体通过农杆菌注射本氏烟草，然后接种病原菌后调查病情指数。与对照组相比，注射含有靶标基因片段农杆菌的植株，病情指数均有所降低，抗性反应型都有所提高。其中，病情指数显著降低与抗性反应级明显提高的基因共有20个，主要为糖代谢、能量代谢与蛋白质代谢相关的基因。3、对腺苷酸激酶（adenylatekinase，AK）、ADP，ATP载体蛋白（ADP,ATPcarrierprotein，AACP）和寡糖基转移酶STT3亚基（oligosaccharyltransferaseSTT3subunit，OSTSTT3）进行分子水平检测。通过生物量测定发现，与对照组相比，转入靶标基因的本氏烟草根、茎和叶中生物量明显减少，下降幅度均达到50%以上，这一结果与叶片中的台盼蓝染色结果相一致；通过对植物体内寄生的病原菌靶标基因的转录水平进行检测发现，靶标基因的转录水平都明显下降，对照组中靶标基因的表达量分别为干扰组的3.5倍（AK），3.7倍（AACP）和6.9倍（OSTSTT3）。4、构建AK、AACP和OSTSTT3稳定遗传的Gateway干扰载体，转化本氏烟草，目前已获得部分阳性植株。本实验利用HIGS技术在本氏烟草内进行大丽轮枝菌致病与生长发育关键基因的筛选，摸索一种更加直接、细致的观察植株与真菌互作、统计病情指数的新方法，并从分子生物学层面上进行验证方案的可行性，为农作物病虫害的防治提供了一定的实验数据和理论基础。
【作者】苏晓峰；
【导师】程红梅；
【作者基本信息】中国农业科学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】棉花黄萎病；寄主诱导的基因沉默；腺苷酸激酶；寡糖基转移酶；ATP载体蛋白；

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