流产布鲁氏菌毒力基因筛选鉴定及其功能研究

流产布鲁氏菌毒力基因筛选鉴定及其功能研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-10-24 分类:参考文献 喜欢:4239
师大云端图书馆

【摘要】布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病,其病原布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,感染后,主要引起动物流产和人的波状热。布鲁氏菌无经典的毒力因子,如质粒,外毒素,溶细胞素,荚膜或内毒素特性的脂多糖分子,其毒力主要体现在入侵宿主细胞并在胞内存活的能力,基于此,布鲁氏菌能感染宿主建立慢性感染,较难被清除,因此研究布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活所需的基因对于阐明布鲁氏菌的致病机制具有重要意义。本研究主要采用信号标签转座子随机突变技术和基因芯片技术分别筛选鉴定布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活所需基因,为研究布鲁氏菌致病机制提供理论研究资料。本研究中,我们通过逐步施压的方法,诱导流产布鲁氏菌S2308产生萘啶酸抗性(Nal)作为筛选标记,以抗性菌株为亲本,构建含8个信号标签的转座子随机突变库,共含有突变株3759株,以BABL/c小鼠为动物模型,共筛选2048株突变株,获得89株减毒株。通过步移PCR鉴定了24株减毒株的插入失活基因,其中获得一株粗糙型布鲁氏菌,鉴定为rfbE基因失活,rfbE基因为布鲁氏菌O-抗原转运系统ATP结合蛋白,为进一步研究该基因的功能,我们通过定向缺失技术构建流产布鲁氏菌rfbE基因缺失株,命名为rfbE,经结晶紫染色和热凝集试验确定rfbE为粗糙表型,生长曲线测定发现rfbE在平台期以后生长略慢于野生株,细胞感染试验发现rfbE缺失株提高了入侵巨噬细胞的能力,但明显减弱其胞内存活的能力,通过形态学分析和荧光染色发现rfbE诱导细胞肿胀坏死。通过对BABL/c小鼠模型致病性分析发现rfbE缺失株明显出现减毒现象,不能在小鼠模型上建立慢性感染。此研究表明,rfbE基因参与LPS合成,是布鲁氏菌毒力所必需的。为深入研究rfbE缺失株的特性,我们通过基因芯片筛选rfbE缺失株差异转录基因,发现asp24基因在rfbE中出现明显的上调转录,随后,通过荧光定量PCR和免疫印迹试验表明Asp24上调表达不是粗糙型布鲁氏菌共有的特征,而是与O-抗原ABC转运子缺失引起O-抗原胞内聚集相关,发现一种新的Asp24上调机制。荧光染色试验表明Asp24不是粗糙型布鲁氏菌致死巨噬细胞的原因,酸诱导性试验表明Asp24确实能在酸性条件下被诱导表达,然而Asp24并不是布鲁氏菌抵抗酸性环境所必需的组分。进一步研究发现,Asp24蛋白在胞内环境下被精确调控表达对于布鲁氏菌胞内存活来说是必不可少的。布鲁氏菌能在宿主体内建立慢性感染与其胞内存活的特性是分不开的,因此鉴定布鲁氏菌胞内存活所需基因对于理解其胞内存活机制非常重要,后续试验中我们通过基因芯片技术筛选鉴定了布鲁氏菌在巨噬细胞内存活状态下差异转录基因,发现7.82%的基因上调转录,5.4%的基因下调转录,荧光定量PCR验证芯片差异大于5倍的基因,共发现14明显差异转录基因,分别为:AraC转录调控子(AraC),DnaA结构域蛋白(Ddp),雌烯醇转录调控子(EryD),碱性磷酸酶(Alp),鞭毛基因棒状蛋白(FlgF),四型分泌系统VirB9组分(VirB9),原儿茶酸2,3双加氧酶(Hpcd),醛脱氢酶家族蛋白(ALDH),主要推动家族转运子(MFS),镍离子转运透化酶和四个假定蛋白基因(BruAb11814,BruAb10475,BruAb11926,BruAb10292),分别参与执行各种不同的功能,本研究表明,布鲁氏菌通过调控多种基因的表达来适应胞内存活的条件,是一个复杂的调控过程。流产布鲁氏菌胞内诱导ddp基因,编码一个DNA结合域蛋白,该基因缺失株表现粗糙型布鲁氏菌的特征,但不能被结晶紫染色,免疫印迹试验分析发现,ddp缺失株仅能合成部分O抗原。粘附入侵试验发现ddp缺失株明显提高了入侵巨噬细胞和上皮样细胞的能力,约为S2308株的10-20倍,另外,ddp缺失株与粗糙型布鲁氏菌相似也能诱导巨噬细胞死亡,减弱在巨噬细胞内的复制能力,与S2308相比,明显激活巨噬细胞辅助抗原递呈分子CD40、CD80、CD86和细胞因子IL-6,IL-10和TNF-α的转录。动物试验显示,ddp缺失株不能在小鼠体内建立慢性感染,减弱对小鼠的致病力。本研究表明ddp基因是布鲁氏菌重要的致病基因,是布鲁氏菌毒力所必需的。总之,本论文通过信号标签随机突变技术和基因芯片技术筛选鉴定了布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活时所需要的基因,研究了布鲁氏菌rfbE基因的功能,发现了一种新的Asp24上调机制,探讨布鲁氏菌胞内存活的诱导基因,研究了胞内诱导ddp基因的功能,为布鲁氏菌致病机制研究提供了理论研究资料。
【作者】田明星;
【导师】于圣青;
【作者基本信息】中国农业科学院,预防兽医学,2014,博士
【关键词】流产布鲁氏菌;信号标签转座子随机突变;基因芯片;毒力基因;

【参考文献】
[1]刘晓辉.轴突导向分子Sema4D参与心肌梗死的基础与临床研究[D].苏州大学,内科学,2013,博士.
[2]曾正明.合成地震记录层位标定方法改进[J].石油地球物理勘探,2005,05:104-106+144+19.
[3]于永江.TH17及白介素IL-21在肺间质纤维化大鼠中的表达及意义[D].佳木斯大学,内科学,2014,硕士.
[4]秦承群,冯奕钰,封伟.红外光驱动聚氨酯基碳纳米复合薄膜的形状记忆性能的研究[A].中国化学会高分子学科委员会.2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题F:功能高分子[C].中国化学会高分子学科委员会:,2013:1.
[5]姜治芳.北京市高新技术企业节能减排效应研究[D].北方工业大学,会计学,2014,硕士.
[6]腾华.党的十七大以来基层党员队伍纯洁性建设研究[D].西南大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2014,硕士.
[7]杜红卫.安徽省自主创新效率评价[D].安徽大学,产业经济学,2013,硕士.
[8]邵芳.1419例乳腺癌临床资料及保乳术患者预后因素分析[D].复旦大学,普通外科,2012,硕士.
[9]罗俊连.广东省清远市国土资源局清新分局公文绩效管理探究[D].中国地质大学(北京),公共管理,2014,硕士.
[10]钱春萍.白藜芦醇抑制心室肌细胞由过氧化氢诱发增大的晚钠电流来缓解钠依赖性钙超载[D].武汉科技大学,生理学,2012,硕士.
[11]曾永安.当前中国行政信访制度的挑战与对策[D].苏州大学,行政管理,2013,硕士.
[12]王莹.公允价值计量对审计质量的影响研究[D].华侨大学,会计学,2014,硕士.
[13]白天明.游丝—摆轮自动分档仪的设计与实现[D].大连理工大学,控制工程(专业学位),2013,硕士.
[14]雷茜.定瓷艺术市场及其定价机制研究[D].河北师范大学,美术学,2014,硕士.
[15]王泉德,王先甲,王先培.数据集划分及关联规则挖掘[J].计算机工程,2003,21:18-19.
[16]梁媛.雌激素受体S309位点基因替代鼠的建立及该位点磷酸化在小鼠乳腺发育中的作用[D].第四军医大学,病理学与病理生理学,2014,硕士.
[17]罗梦淇.“自我定位”在解决大学生择业心理问题中的作用研究[D].浙江大学,思想政治教育,2013,硕士.
[18]韩仲武.核电救灾机器人辐射屏蔽材料性能模拟研究[D].华东理工大学,化工过程机械,2014,硕士.
[19]石荣.基于数据的人体运动编辑关键技术研究与系统平台实现[D].杭州电子科技大学,计算机软件与理论,2011,硕士.
[20]刘应晟.基于DSP的某飞行器姿态控制系统软件设计[D].西安工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[21]杜杰.德阳移动中高端客户流失预警研究[D].电子科技大学,工商管理(专业学位),2013,硕士.
[22]刘晶.农田水利建设专项资金管理问题研究[D].南昌大学,公共管理(专业学位),2012,硕士.
[23]宋卫东.数据流管理系统的研究与设计[D].南京航空航天大学,2005.
[24]王凤丽.基于纳米铜和石墨烯的化学修饰电极构建及其在离子色谱中的应用[D].浙江大学,2014.
[25]胡伯韬.腹腔手术机器人视觉系统的研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[26]刘珂.断裂、过渡和以太演绎[D].复旦大学,外国哲学,2012,博士.
[27]毛晓杰.SE03转子自动动平衡机校正精度的提升研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2014,硕士.
[28]索南加乐,邓旭阳,焦在滨,刘凯,刘东.基于故障分量综合阻抗的母线保护新原理[J].电力系统自动化,2008,08:34-38+48.
[29]张小舟.美团网发展战略研究[D].山东大学,工商管理(专业学位),2013,硕士.
[30]丛爽,DeCarliAlessandro.两种补偿动态摩擦力的先进控制策略[J].自动化学报,1998,02:94-98.
[31]李耀通,韩珂.一种基于Lyapunov的机器人直角坐标系轨线控制[J].自动化学报,1991,01:33-39.
[32]杨丽惠.管理咨询公司的激励机制研究[D].东北师范大学,情报学,2012,硕士.
[33]姜文超.加入情感组织者对抑郁症治疗效果的影响临床实验研究[D].辽宁师范大学,应用心理学,2011,硕士.
[34]杜丽莎.eATP对拟南芥暗生长幼苗生长发育的影响及其信号转导机制[D].河北师范大学,植物学,2013,硕士.
[35]胡方.基于网络环境的内部会计控制研究[D].中南大学,2003.
[36]陆玮.复杂化学体系测量数据的主因子数估计方法研究[D].中国科学技术大学,分析化学,2014,硕士.
[37]彭晓群,吴丰,张延华.柴达木盆地小梁山地区混积岩储层测井评价[J].石油地球物理勘探,2012,S1:136-139+151+170+162.
[38]王文艳.新型办公空间家具设计研究[D].山东工艺美术学院,家具设计,2013,硕士.
[39]王惠明.PC在Accu-Roll轧管机上的应用[J].冶金自动化,1993,04:48-50.
[40]许雯靓.石墨烯修饰电极对苯二酚的测定及石墨烯的生物效应研究[D].武汉理工大学,2013.
[41]林雪.居延汉简字体风格研究[D].河北师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[42]陆文峻.Cu~0促进的2-一溴二氟甲基-1,3-苯并二唑与卤代芳烃/烯烃的交叉偶联反应研究[D].上海大学,有机化学,2013,硕士.
[43]董春旻.君子扶正汤对MFC荷瘤小鼠的抑瘤作用及对巨噬细胞吞噬功能与溶血素水平的影响[D].吉林大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[44]占金刚,刘恩平,刘海清,汪佳滨.海南省鲜销农产品物流发展的特点及SWOT分析[J].热带农业科学,2014,05:86-89+94.
[45]孙亚飞,李力.钢材含碳量电磁无损检测方法[J].冶金自动化,2011,02:4-10.
[46]钟里卉.城镇污水处理项目的公众价值研究[D].武汉纺织大学,企业管理,2014,硕士.
[47]温香彩,刘永清.具有非线性关联的广义分散系统的镇定问题[J].控制与决策,1997,04:301-306.
[48]束海波.收益差异对研发网络合作演化的影响研究[D].杭州电子科技大学,技术经济及管理,2014,硕士.
[49]张智勇.大型热连轧层流冷却过程控制系统的设计与实现[D].东北大学,控制工程,2011,硕士.
[50]谭征兵.矿产资源GIS评价系统及成矿预测BP模型[D].中国地质大学(北京),2003.

相关推荐
更多