预后营养指数对恶性胸膜间皮瘤预后的影响及黄连素诱导其凋亡、自噬的机制研究

【摘要】研究背景：恶性胸膜间皮瘤(malignantpleuralmesothelioma,MPM)是一种恶性程度高、较为罕见的肿瘤,环境的石棉暴露是主要的致病因素。虽然近些年来石棉的使用量在世界范围内减少,但是由于其潜伏期长(约20-40年),本病的发病率仍在持续上升。MPM预后不良,其确诊后中位生存期约12个月,关于MPM的预后分析,国内缺乏大宗的病例报道,数据主要来源于国外。因此,本课题在第一部分首先回顾性分析了121例病理确诊为MPM的患者的临床病理特征并对其随访资料进行生存分析,研究治疗前预后营养指数(prognosticnutritionalindex,PNI)与患者临床病理特点、预后的相关性,探讨PNI在判定MPM预后中的作用和临床意义。MPM的治疗方法主要有手术治疗、化学治疗、放射治疗以及三峰治疗等方法,但是效果均不理想,尽管目前培美曲塞联合应用铂类制剂的一线化疗方案或三峰治疗取得了一定的临床效果,可以改善患者的生存率,但是仍然缺乏理想的疗效,且化疗毒副作用较大,目前仍无统一的治疗方法。因此亟需寻找新型有效且毒副作用低的治疗方法。黄连素是一种从黄连、三颗针、黄柏等植物中提取出来的异喹啉生物碱,它具有广泛的药理学作用。近年来,有研究表明其具有显著的抗肿瘤作用,已经在肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤中得到证实。黄连素主要是通过抑制肿瘤细胞增殖,调控细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤侵袭转移等方式来发挥作用。另外,近来有报道,黄连素可以通过诱导细胞自噬发挥抗肿瘤的作用。但是目前仍未有黄连素在间皮瘤治疗中的报道。因此本课题的第二部分应用体外实验研究黄连素对人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞的作用,并进一步探讨凋亡和自噬在黄连素治疗间皮瘤过程中的作用及相关分子机制。第一部分预后营养指数与恶性胸膜间皮瘤预后的相关性研究目的：本部分研究通过对121例MPM患者的临床病理特点及随访资料进行生存分析,研究治疗前PNI与患者的临床病理特点、预后的相关性,探讨PNI在判定MPM预后中的作用和临床意义。方法：2001年10月-2013年1月间于山东省立医院呼吸科、齐鲁医院呼吸科、山东省胸科医院结核科行内科胸腔镜检查病理诊断为MPM的患者121例,收集患者的临床病理及实验室资料,并对患者进行随访,收集随访资料。PNI计算公式为：10×血清白蛋白值(g/d1)+0.005×外周血淋巴细胞计数(/mm3)。应用单因素及多因素生存分析,检测PNI及各项临床病理参数对预后的影响。结果：1.全组患者平均PNI值为44.6±6.3,PNI与年龄、吸烟史及体重减轻明显相关(P<0.05)。2.本研究将PNI的平均值44.6作为界值将全组患者分为两组：低PNI组(PNI<44.6；n=60；49.6%)及高PNI组(PNI≥44.6；n=61；50.4%)。截止到最后随访时间,121例患者中,有77例(66.3%)死亡,其中高PNI组31例,低PNI组46例。全组患者的中位累积生存时间为15个月(0.3-86个月)。低PNI患者中位累积生存时间为11个月,明显短于高PNI患者的18个月,低PNI患者的1年及2年总生存率分别低于高PNI患者的1年总生存率(45.5%VS72.3%)及2年总生存率(18.4%VS38.7%；Kaplan-Meier法、Log-rank检验P=0.003)。3.低PNI患者较高PNI患者有更高的死亡风险(HR[hazardratio]:2.290:95%CI[confidenceinterval]:1.415-3.706:P=0.001)。结论：PNI是判定MPM总生存率的独立预后因素,低PNI患者较高PNI患者有更高的死亡风险。第二部分黄连素诱导人胸膜间皮瘤细胞凋亡与自噬及分子机制研究目的：研究黄连素对人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞的作用,并进一步探讨凋亡和自噬在黄连素治疗间皮瘤过程中的作用及相关分子机制。方法：一、黄连素诱导人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞凋亡作用的研究不同浓度黄连素干预人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞系,应用MTT法检测细胞的增殖活性；应用Hoechst33258染色及AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡；应用westernblot分析黄连素诱导NCI-H2452细胞凋亡的分子机制。二、黄连素诱导人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞自噬作用的研究黄连素作用于人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞系,应用免疫荧光法检测细胞内自噬特异性标记物LC3的分布；应用westernblot探讨黄连素诱导NCI-H2452细胞自噬相关蛋白的表达以及自噬抑制剂及自噬激动剂对黄连素诱导的自噬的影响。三、自噬在黄连素诱导人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞死亡过程中的作用应用MTT法检测自噬抑制剂3-MA抑制自噬后对黄连素引起的NCI-H2452细胞增殖抑制的影响；用凋亡抑制剂、自噬抑制剂、自噬激动剂分别联合黄连素干预间皮瘤细胞,然后应用台盼蓝染色法探讨黄连素诱导的间皮瘤细胞死亡过程中凋亡与自噬的作用；应用AnnexinV-PE/7-AAD双染法及westernblot探讨黄连素诱导间皮瘤NCI-H2452细胞自噬与凋亡的关系。结果：一、黄连素诱导人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞凋亡作用的研究1.黄连素可以显著抑制NCI-H2452细胞增殖,呈剂量及时间依赖性。2.Hoechst33258染色及AnnexinV-PE/7-AAD双染法结果显示黄连素可以诱导细胞的凋亡,与对照组比较,当用100μM的黄连素干预细胞48小时后,凋亡率由对照组的4.55±0.96%显著上升至34.23±1.16%(P<0.001)。3.Westernblot结果显示黄连素可能是通过caspase-9介导的内源性线粒体途径促进间皮瘤细胞凋亡。二、黄连素诱导人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞自噬作用的研究1.LC3免疫荧光可见LC3的分布由未处理组的广泛弥漫型分布变为黄连素处理组的核周针尖样、颗粒样分布。2.黄连素增加LC3II的表达,下调p62的表达,并呈时间剂量依赖性。3.3-MA可以抑制而雷帕霉素可以增加黄连素诱导的自噬。三、自噬在黄连素诱导人胸膜间皮瘤NCI-H2452细胞死亡过程中的作用1.黄连素以剂量依赖性杀死细胞,当黄连素浓度达到200μM干预细胞48小时时,细胞死亡率达到34.66±5.32%(P<0.001)。2.抑制凋亡降低黄连素诱导的细胞死亡率,z-VAD-fmk能够显著逆转黄连素诱导的NCI-H2452细胞死亡,说明凋亡参与黄连素诱导的细胞死亡3.抑制自噬增加、诱导自噬降低黄连素诱导的NCI-H2452细胞死亡率。4.抑制自噬增加黄连素诱导的NCI-H2452细胞凋亡。结论：1.黄连素可以诱导间皮瘤NCI-H2452细胞发生凋亡,可能是通过caspase-9介导的内源性线粒体途径促进间皮瘤细胞凋亡2.黄连素可以诱导间皮瘤NCI-H2452细胞发生自噬,下调p62蛋白表达。3.凋亡是黄连素诱导的间皮瘤NCI-H2452细胞死亡的主要形式,自噬是一种应激反应,可能是通过阻止细胞凋亡而对细胞起到的一种保护作用,抑制自噬可以增加细胞凋亡,增强间皮瘤NCI-H2452细胞对黄连素的敏感性。创新性和意义：1.本课题首次发现PNI为MPM的不良预后指标。2.本课题首次在MPM中研究了黄连素对肿瘤细胞生长增殖、凋亡及自噬的影响。3.本课题首次在MPM中研究了自噬在黄连素诱导的细胞死亡中的作用,为以自噬为靶点进行抗肿瘤治疗提供理论依据。
【作者】姚周虹；
【导师】林殿杰；
【作者基本信息】山东大学，内科学，2014，博士
【关键词】恶性胸膜间皮瘤；预后营养指数；黄连素；自噬；凋亡；

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