基于PAMAM联合包载siRNA与PTX靶向给药系统的构建

【摘要】目的：本文以PAMAM为载体，以具有主动靶向功能的HA为被膜材料，构建PAMAM/HA用于递送靶向VEGFmRNA的siRNA，诱导RNAi，通过抗血管生成控制肿瘤生长。由于单一的抗血管生成疗法无法快速、完全消除肿瘤及PAMAM/HA无法完全避免体内RES吞噬作用的缺陷，在上述复合物的基础上，将HA进行PEG化后包覆PAMAM用于联合递送靶向VEGF的siRNA和抗肿瘤化疗药物PTX，构建兼具靶向及长循环双重功能的联合载药系统siRNA/PTX/PAMAM/HA-PEG，以期增强体内抗肿瘤作用，实现低毒高效的抗肿瘤效果。方法：本文构建了不同HA包覆修饰量的siRNA/PAMAM/HA（SPH）复合物，琼脂糖凝胶电泳进行siRNA阻滞实验，激光粒度分析仪测定粒径及电位，MTT法测定细胞毒性，采用荧光显微镜和流式细胞仪对复合物的摄取进行考察，从而筛选出最佳的HA包覆量。通过酰胺化反应合成HA-PEG，经纯化后通过1H-NMR对产物结构进行表征。通过静电吸附及物理包埋法构建siRNA和PTX共递送的复合物载药系统siRNA/PTX/PAMAM/HA-PEG（SPPG），通过siRNA阻滞实验、稳定性实验、粒径、电位、形貌和包封率等对复合物进行表征。MTT法测定细胞毒性，流式细胞仪、HPLC定量考察复合物的摄取情况，RT-PCR测定复合物的RNAi效果，通过流式细胞仪和共聚焦显微镜分别考察复合物的内吞机制和细胞内定位。采用小动物活体荧光成像技术观察复合物在体内的分布情况。结果：激光粒度分析仪测定结果表明，随着HA包覆比例的增加，SPH的粒径增加，zeta电位降低。MTT和细胞摄取实验表明，HA的包覆使复合物的细胞毒性下降；HA的包覆能增加细胞对该复合物的摄取，增强复合物的主动靶向性，并且当HA的包覆量为25%（电荷比）时，细胞摄取量最高。1H-NMR检测结果显示成功合成HA-PEG。siRNA/PTX/PAMAM（SPP）、siRNA/PTX/PAMAM/HA（SPPH）、siRNA/PTX/PAMAM/HA-PEG（SPPG）的粒径依次增大，电位降低。细胞实验表明，HA的包覆使细胞对复合物的摄取最高，RNAi效果最强；而HA-PEG的包覆摄取虽然比未有包覆的复合物低，RNAi效果二者却未有明显差异。摄取机理研究结果表明，三种复合物的细胞摄取均为能量依赖的转运过程，SP经网格蛋白途径入胞，SPH及SPG经网格蛋白及小窝蛋白多种途径入胞。动物实验表明，SPPH及SPPG均可不断向肿瘤部位蓄积，具有主动靶向功能；且SPPG能够在肿瘤部位获得较长时间的累积，具有一定的长循环作用。结论：本文以PAMAM为载体，通过合成HA-PEG，构建了毒性较低的用于siRNA及PTX共递送的载药系统SPPG，在保留HA主动靶向的基础上，兼备了长循环功能，将基因疗法与传统的化疗相结合，有望实现较高的体内抗肿瘤作用。
【作者】张璐；
【导师】陈大为；
【作者基本信息】苏州大学，药剂学，2014，硕士
【关键词】PAMAM；透明质酸；靶向递药；聚乙二醇；siRNA；紫杉醇；

【参考文献】
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