SIRT1抑制剂EX527对人肺癌A549细胞顺铂敏感性影响的体外研究

【摘要】目的在我国肺癌总体发病率已位居恶性肿瘤第一位，肺癌恶性程度高，治疗效果不是很理想，5年生存率不高。顺铂是化疗常用药物之一，属于细胞周期非特异性药物，导致DNA复制障碍，从而抑制肿瘤细胞分裂。SIRT1属于III类组蛋白去乙酰酶，在肺癌的发生发展中具有重要的作用，对于肺癌细胞的化疗敏感性可能也有重要影响。EX527是新型的一种特异性的高效的SIRT1抑制剂，本实验试图在体外实验中观察EX527对人肺癌A549细胞顺铂敏感性的作用，并观察在这过程中SIRT1及其靶分子蛋白的变化。方法1.采用MTT法测定EX527与顺铂联合处理对A549细胞活力的作用，2.采用细胞计数的方法测定EX527与顺铂联合处理对A549细胞增殖能力的影响。3.采用3H-TDR掺入法测定EX527与顺铂联合处理对A549细胞DNA合成能力的影响。4.分别采用逆转录PCR和WesternBlotting来测定SIRT1在mRNA和蛋白水平表达的变化，5.采用SIRT1活性测定试剂盒测定EX527与顺铂联合处理对A549细胞SIRT1活性的变化。6.分别采用DAPI和AnnexinV-FITC染色法，在流式细胞仪上检测EX527与顺铂联合处理对A549细胞周期分布和细胞凋亡的作用，7.采用DCFH-DA染色法测定A549细胞内活性氧的变化，采用WesternBlotting来测定SIRT1靶分子乙酰化和表达水平的改变。结果1.顺铂和EX527单独处理A549细胞都使细胞活力下降，并具有浓度依赖性和时间依赖性，EX527联合顺铂处理A549细胞活力下降明显低于顺铂处理组，具有统计学差异，EX527能增强顺铂对A549细胞的增殖和DNA合成抑制功能，EX527能够增强顺铂诱导的G1期阻滞，诱导生成更多的SubG1期细胞，细胞凋亡更多。2.顺铂单独处理、EX527单独处理和联合处理组之间SIRT1mRNA水平没有显著的变化，顺铂处理可以显著升高SIRT1蛋白在A549细胞中的表达水平，而EX527处理则没有明显的作用，而且EX527不能抑制顺铂诱导的SIRT1蛋白表达，EX527能够降低A549细胞内源SIRT1的活性，而且显著抑制由于蛋白水平升高导致的SIRT1的去乙酰化酶活性的升高。3.顺铂可以升高A549细胞内的活性氧成分，而且EX527可以进一步提升细胞内的活性氧水平。EX527可以升高乙酰化p53的水平和Foxo3a及p21的表达水平。结论EX527能够明显增强A549细胞对顺铂的敏感性，表现在细胞活力的降低、细胞增殖速度的减慢、DNA合成的抑制。EX527不是通过改变SIRT1的mRNA或蛋白表达水平来抑制其功能的，而是通过直接抑制SIRT1的去乙酰化酶活性。EX527增强A549细胞对顺铂的敏感性可能的机制有：1.G1期细胞阻滞和细胞凋亡有关，2.与诱导更高水平的细胞内活性氧水平有关。3.EX527可以提高p53的乙酰化水平，增强p53的促细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用，4.提高Foxo3a和p21的表达水平，增强抑制肿瘤细胞的作用，减低对顺铂的抵抗性。
【作者】丁祥林；
【导师】陶敏；
【作者基本信息】苏州大学，肿瘤学，2014，硕士
【关键词】A549细胞；顺铂；SIRT1；EX527；

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