鬼臼酰肼哌啶氮氧自由基腙（GP-1）对人结肠癌SW620细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响

【摘要】背景与目的结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一,于欧美等发达国家发病率、死亡率较高。近年来,随着经济、生活水平的提高,我国居民结肠癌的发病率也逐年攀升,死亡率持续增高。结肠癌的发病原因及机制至今尚未阐明,可能是由遗传因素及生活方式等相关因素共同决定的。作为恶性肿瘤中特定的一个种类,结肠癌除具有恶性肿瘤共同的特征(如不受限制的生长、浸润破坏、消耗机体及远处转移等)外,尚有其个性特征(如因易与肠炎、痔、单纯性贫血混淆而延误最佳治疗时机)。所以,结肠癌对人体最大的影响仍是失去控制的无限生长、早期转移。目前,针对结肠癌的治疗仍以手术和放化疗为主,虽然经过手术方式的优化选择、化疗药物的不断发展和放疗的运用,结肠癌术后的五年生存率有了较大改善,但不可否认的是,仍有相当一部分患者出现了术后早期转移灶,而放化疗对正常组织细胞的杀伤在很大程度上影响了患者的生活质量。因而,若能有效抑制肿瘤细胞的无限增殖及超强的侵袭能力,可在很大程度上提高肿瘤的治疗效果。鬼臼毒素是一种存在于盾叶鬼臼、桃儿七、八角莲、山荷叶等植物中的木质素类化合物,已有研究证明,以其为基础骨架合成的多种衍生物由于结构特征不同,而表现出不同的生物活性,包括抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用。已被证实该类成分对不同组织来源的肿瘤具有作用,包括肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病和淋巴瘤等癌症。其中GP-1具有较强的抗癌活性,可将多种肿瘤细胞阻滞于G2/M期,从而诱导肿瘤细胞凋亡。前人研究发现,其抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的可能机制有两种：破坏微管代谢平衡；影响DNA拓扑异构酶的作用。但有关GP-1对肿瘤细胞转移侵袭的影响及机制尤其是对于结肠癌的研究目前较少。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)在肿瘤的侵袭、转移过程中发挥重要的作用,它是一族依赖于金属离子Zn2+的蛋白水解酶类,其重要作用便是介导肿瘤细胞降解宿主的细胞外基质,促进肿瘤血管新生,易化肿瘤细胞的扩散、转移。该家族已发现的24个成员中,起重要作用的是MMP-2和MMP-9,它们与结肠癌的关系密切。有体外研究表明抑制MMP-2、MMP-9的表达可明显降低肿瘤细胞的侵袭能力,而GP-1能否降低结肠癌细胞的迁移侵袭能力及其与MMP-2、MMP-9表达的关系尚未见报道。恶性肿瘤组织中普遍存在着血管新生,而血管新生是瘤体持续生长、侵袭转移的物质基础,因而抑制血管新生可以减少肿瘤的血供,极大地限制肿瘤的细胞的生长,并最终改善患者的预后。并且此类药物具有特异性强、正常组织不易受损、不易发生耐药、抗瘤谱广等优势。血管内皮生长因子(VEGF)家族中的VEGF-A是迄今发现的作用最强的促血管生成因子,它主要作用于血管内皮细胞,传递细胞增殖信号,其介导的信号级联通路是血管新生的关键调节途径。因此阻断VEGF介导的血管新生信号通路,可有效抑制肿瘤生长和细胞增殖。研究显示,一些从天然植物中提取的小分子物质明显具有抗肿瘤血管生成的作用,因而GP-1是否具有此种功能也值得研究。故本研究选用人结肠癌细胞SW620细胞株观察GP-1抗结肠癌细胞增殖、迁移侵袭及诱导凋亡的作用,初步探讨其相应的机制,并尝试说明其对SW620细胞VEGF表达的影响,为结肠癌的药物治疗寻找新的方向。方法1、采用不同浓度梯度的GP-1作用于人结肠癌SW620细胞24h和48h,倒置显微镜观察GP-1作用前后人结肠癌SW620细胞形态改变,以CCK-8实验检测GP-1对结肠癌细胞增殖的影响,计算IC50,选取合适条件进行后续实验。2、运用基底膜重建实验进行细胞侵袭实验,观察GP-1对人结肠癌SW620细胞侵袭能力的影响。3、流式细胞术AnnexinV/PI双染检测GP-1对人结肠癌SW620细胞凋亡的影响。4、ELISA实验检测GP-1处理后人结肠癌SW620细胞培养液上清中侵袭相关因子基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性水平。5、实时定量PCR检测GP-1作用后人结肠癌SW620细胞中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和VEGF基因表达水平,以探讨其可能的机制。结果1、倒置显微镜观察到GP-1处理后SW620细胞细胞团变小,且数目减少,部分细胞变圆。CCK-8检测结果显示随着浓度的加大和作用时间的延长,GP-1对SW620细胞的增殖抑制作用逐渐增强,呈现明显的时间-剂量效应关系(P<0.05)。最大浓度作用24h、48h后的抑制率分别为78.37%、84.84%,24h、48h时的IC50分别为30.09ug/ml、18.87ug/ml的浓度范围及24h作用时间为后续实验条件。2、基底膜重建实验显示,GP-1能明显抑制SW620细胞的侵袭并呈浓度依赖性,在12.5ug/ml浓度作用24h后其抑制率为16.84%,50.0ug/ml下其抑制率可达47.45%。3、流式细胞仪检测细胞凋亡结果表明GP-1对SW620细胞凋亡虽有一定程度的影响但效果并不太显著,其早期凋亡从12.5ug/mlGP-1作用下的(5.18±0.91)%增加至50Oug/mlGP-1作用时的(5.62±0.77)%,各实验组与对照组(早期凋亡率为[4.87±0.63]%)比较无显著性差异。4、酶联免疫吸附法结果提示,GP-1干预后SW620细胞的MMP-2、MMP-9表达水平随作用浓度增加而逐渐下降,25.0ug/ml、50.Oug/ml组相对于对照组有显著性差异。5、RT-PCR分析表明经GP-1处理后实验组中SW620细胞组的MMP-2、MMP-9及VEGF基因的mRNA表达水平均明显低于阴性对照组(P<0.05),不同浓度之间相比有统计学意义。结论1、GP-1在体外可明显抑制结肠癌细胞增殖,但诱导结肠癌细胞凋亡的作用不明显。2、GP-1可抑制结肠癌细胞的侵袭能力,其机制可能是在转录和翻译水平上抑制基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达。3、GP-1可下调结肠癌细胞VEGFmRNA的表达,表明其可能有抑制结肠癌血管生成的作用。
【作者】王亚楠；
【导师】陈晓；
【作者基本信息】兰州大学，外科学，2014，硕士
【关键词】鬼臼酰肼哌啶氮氧自由基腙(GP-1)；结肠癌；增殖；侵袭；机制；

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