FGFR3真核表达载体的构建及其在慢性粒细胞白血病细胞系K562中的作用研究

【摘要】研究背景：慢性粒细胞白血病（chronicmyeloidleukemia,CML）是一种粒细胞增生性疾病，占成人白血病的15-20%[1]。虽然伊马替尼等药物的临床应用使得无法进行造血干细胞移植的病人病程得以控制，但这些药物并不能治愈CML，因为这些药物无法清除白血病干细胞，进而使得疾病复发[2]。另外伊马替尼类药物的价格异常昂贵，病人往往无法支付高额的医药费用，而放弃治疗或延误治疗时间，所以解决白血病干细胞的耐药问题是治疗本病的关键。在多种肿瘤中发现FGFR3突变或过表达，如多发性骨髓瘤[3]、尿路上皮肿瘤[4]、膀胱癌[5]、口腔[6]、睾丸癌[7]和大肠癌[8]等。FGFR3信号的增强促进了肿瘤细胞的增殖、生存、迁移和耐药等多种生理功能。前期研究结果揭示，FGFR3可能与CML白血病的发生发展存在着密切的关系。如FGFR3在K562细胞中的表达明显高于其它各种急性白血病细胞系，FGFR3在CML白血病干/祖细胞（CD34+）中的表达也明显高于分化较成熟的白血病细胞（CD34-），这与国外文献的报道一致[9]，表明FGFR3与慢性粒细胞白血病的发生和发展以及白血病干细胞的耐药可能都有密切的关系。为了探讨FGFR3信号与CML发生发展及耐药的关系，本课题克隆了野生型和截短失活型的FGFR3基因，并构建了真核表达载体，通过脂质体转染和药物筛选，建立了过表达野生型和截短失活型FGFR3基因的K562细胞系，并研究了FGFR3基因在CML中的功能，为慢性粒细胞白血病的发病机制研究奠定了基础。目的：构建FGFR3真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN，并检测其在人白血病细胞系K562中的表达，在转染FGFR3-DN同时给予Imatinib经典治疗CML药物，初步观察转染FGFR3-DN治疗效果，为后续探讨FGFR3在治疗慢性粒细胞白血病中的作用及其耐药机制奠定基础。方法:通过PCR方法获得FGFR3全长基因（fgfr3-WT）和截短失活型的FGFR3（fgfr3-DN），经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接，构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。PCR、双酶切及测序鉴定正确后，经脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中，经puromycin抗性筛选后，应用Westernblotting和流式细胞术方法检测细胞中FGFR3蛋白的表达，应用CCK8法检测重组质粒FGFR3转染K562稳转细胞细胞增殖能力影响，应用CFU实验检测FGFR3对K562细胞克隆形成能力的影响。结果：MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒PCR结果鉴定显示，2个质粒分别能扩增出在2400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1200bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1200bp的fgfr3-DN基因。双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒，也能够获得2400bp的目的基因片段。测序结果显示，fgfr3-WT大小为2400bp,Blast对比分析表明，测序结果与GeneBank中的FGFR3序列完全一致。Fgfr3-DN大小为1200bp,与预先设计的序列完全一致,表明野生型FGFR3和截短失活型FGFR3真核质粒表达质粒构建成功。Westernblotting检测分析，MSCV/puro-fgfr3-WT转染组（K562-WT）与对照组（K562-MSCV）相比，有较高的FGFR3蛋白表达，表达量是对照组的10倍以上。MSCV/puro-fgfr3-DN转染组（K562-DN）有较高的截短型的FGFR3（K562-DN）表达，而对照组和K562-WT转染组则无此片段。流式细胞术方法检测显示fgfr3-WT中有57.5%的细胞高表达FGFR3，K562-DN有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。CCK8结果显示转染FGFR3-DN后，与空质粒组相比，K562细胞增殖明显减少<0.05）；克隆形成试验也证明FR3-DN组较空质粒组细胞增殖较缓慢。结论：1.成功构建了高表达野生型和截短失活型FGFR3的表达载体。2.成功构建了高表达野生型和截短失活型FGFR3的人白血病细胞系K562。3.通过CCK8及CFU实验证明了FGFR3促进K562细胞的增殖。
【作者】杜彤华；
【导师】夏大文；
【作者基本信息】吉林大学，临床医学，2014，硕士
【关键词】FGFR3；K562细胞系；稳定转染；伊马替尼；

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