细胞骨架对狂犬病病毒感染与复制的影响

【摘要】狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引起的、以神经系统感染为特征的高度致死性人兽共患病毒性传染病。在RABV自然感染病例中出现典型的神经症状，脑组织内很难检测到明显的神经元凋亡，但却造成了神经细胞骨架结构改变。神经细胞骨架是维持神经细胞正常生理功能的结构基础。为研究神经细胞骨架和RABV致病性的关系，本文以细胞骨架作为药物靶点，通过检测细胞骨架抑制剂对RABV感染细胞的影响，并结合对骨架调节蛋白的分析及构建骨架蛋白融合荧光质粒，研究RABV感染与细胞骨架动态变化的关系。这些研究可为阐释RABV感染致神经功能异常提供理论依据，并为深入探究狂犬病致病机制奠定基础。本研究首先通过MTT法检测秋水仙素（Col）和细胞松弛素D（CytoD）两种骨架特异性抑制剂对人神经瘤细胞SH-SY5Y活性影响，并进行形态学观察、免疫荧光鉴定，初步筛选了两种骨架特异性抑制剂的适宜浓度。随后通过在RABV感染前后使用骨架抑制剂，应用间接ELISA、RT-PCR、Westernblotting及免疫荧光，分析两种抑制剂对病毒感染和复制的影响。此外，还应用Westernblotting对RABV感染条件下，两种重要骨架蛋白——微管结合蛋白tau蛋白和微丝结合蛋白arp2/3蛋白的表达水平变化进行了检测。最后构建了与荧光蛋白融合的细胞骨架蛋白质粒，以期研究RABV感染对细胞骨架的动态改变。结果显示，Col浓度为0.065mmol/L、0.13mmol/L及CytoD浓度为0.25μg/mL、0.5μg/mL时，细胞形态及细胞骨架与正常对照无显著差异(P>0.05)。先用骨架抑制剂处理细胞，可使RABV滴度显著下降(P<0.05)，CytoD的作用较Col明显，这一结论被RABVG基因mRNA水平及病毒特异性免疫荧光检测所证实；而在RABV感染细胞后使用骨架抑制剂，Col对RABV滴度的影响较CytoD更明显，Westernblotting结果显示，RABVG蛋白和N蛋白受到明显抑制，病毒特异性免疫荧光斑块数量也明显减少。在研究RABV感染对tau蛋白和微丝结合蛋白arp2/3蛋白表达水平变化时发现，RABV感染后4h细胞内ARPC3表达上调，而tau和P-tau变化不明显；而RABV感染后72h，ARPC3表达水平下降，P-tau表达水平有所升高。最后本实验还构建了带有绿色荧光标记的细胞骨架质粒pLEGFP-actin和pLEGFP-tubulin，并成功转染了SH-SY5Y细胞。通过本研究，可得出如下结论：1）在SH-SY5Y细胞上筛选了秋水仙素（Col）和细胞松弛素（CytoD）的适宜浓度。2）CytoD对RABV感染的抑制效果比Col的更明显；3）Col对RABV复制的抑制效果较CytoD更明显；4）RABV感染早期可使ARPC3蛋白表达上调，后期下降，而对tau蛋白表达水平影响不大，仅晚期P-tau蛋白表达水平有所增加。5）成功构建了带有荧光标记的微丝和微管骨架蛋白质粒并转染了SH-SY5Y细胞。
【作者】侯金利；
【导师】张茂林；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】狂犬病病毒；细胞骨架抑制剂；秋水仙素；细胞松弛素D；

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