oxLDL诱导小鼠足细胞脂质蓄积和CXCL16表达以及辛伐他汀干预的研究

【摘要】研究背景和目的：自1982年,Moorhead等首次提出“脂质肾毒性”学说以来,大量的研究结果表明,高脂血症和脂质在肾脏沉积是发生肾小球硬化的重要危险因素,而肾小球硬化的病理生理和组织学变化,如血脂异常、病变早期表现内皮损害、后期出现系膜细胞增殖及细胞外基质积聚,这些机制与动脉粥样硬化的发病机制相似,因此提出了“肾小球动脉硬化”这一概念。近年来,氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在肾小球硬化及间质纤维化中的作用越来越受到关注,成为研究热点。临床和实验研究表明,高脂血症可以使oxLDL在肾脏沉积、炎症细胞浸润、肾脏固有细胞增生和损伤、细胞外基质积聚及泡沫细胞形成,直接或间接地导致肾小球硬化。既往对脂质在肾脏沉积导致肾损害的研究,多集中在肾脏系膜细胞及内皮细胞,而Joles的实验证明oxLDL可以同时对肾脏系膜细胞、内皮细胞和足细胞造成损伤,在诸多损伤中足细胞可能是最主要的受害者。足细胞是一种高度分化的肾脏固有细胞,在体内足细胞伸出足突包绕在肾小球基底膜(GBM)上,形成裂孔隔膜(slitdiaphragm,SD)复合体,这一结构在维持肾小球滤过屏障中起重要作用。足细胞损伤是肾病蛋白尿形成的重要原因之一,在肾小球硬化的发生、发展中起重要作用。Bussolati等研究发现oxLDL能够介导足细胞SD蛋白nephrin表达缺失而致细胞损伤,但有关oxLDL介导足细胞损伤的具体调控机制,尚未得到深入的研究,因此建立可靠的oxLDL诱导肾小球足细胞脂质蓄积模型,探索影响足细胞摄取oxLDL的机制,对于减轻足细胞损伤以及延缓肾小球硬化而言,可能是一种极具前景的治疗策略。Gutwein等的体内和体外实验证明在人肾组织足细胞上存在CXC趋化因子配体16(CXCchemokineligand16,CXCL16)的表达。CXCL16在体内有两种存在形式：膜结合型CXCL16和可溶型CXCL16。跨膜CXCL16的一个重要作用是oxLDL的清道夫受体。oxLDL通过细胞膜上的清道夫受体介导进入细胞,造成细胞内脂质大量积聚,导致泡沫细胞形成。金属蛋白水解酶10(adisintegrinandmetalloprotease10,ADAM-10)是两种形式转化的关键因素,参与诱导CXCL16从细胞膜的脱落。新近的研究认为,炎性细胞因子如干扰素-γ(INF-γ)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)可以增加CXCL16在人足细胞内以及可溶形式的表达。有关跨模型CXCL16是否参与体外培养鼠源性肾小球足细胞oxLDL摄取,以及干扰素-γ和ADAM10抑制剂可能的调控作用,国内外研究甚少。他汀类药物是近年来发现的有效的调脂药。大量实验和临床研究资料显示,该类药具有显著的降脂作用。他汀类药物在体内主要的作用是通过选择性阻断胆固醇合成的限速酶结合位点,影响胆固醇生物合成,同时代偿性促进低密度脂蛋白(LDL)受体合成,加速LDL降解,从而降低血脂。目前研究发现,他汀类药物不仅有依赖降血脂的肾脏保护作用,而且还有抗细胞增殖、抗炎症、免疫调节及抑制清道夫受体表达等非依赖降血脂的肾脏保护作用,但确切机制尚不明确。辛伐他汀是最有效、应用最为广泛的一种他汀类药物,目前关于辛伐他汀对清道夫受体介导的鼠源肾小球足细胞脂质蓄积的影响尚未见报道。本研究首次采用油红染色观察小鼠肾小球条件性永生足细胞对oxLDL摄取情况,探讨足细胞摄取oxLDL与CXCL16蛋白表达的关系,旨在建立oxLDL诱导足细胞脂质蓄积模型,为研究足细胞摄取oxLDL的机制及其可能存在的调控因素提供可靠的实验基础。通过体外观察INF-γ、CXCL16特异性抗体和ADAM10抑制剂对足细胞摄取oxLDL的影响以及CXCL16蛋白表达的变化,初步探讨可能调控足细胞脂质氧化损伤的因素。此外,通过观察辛伐他汀对oxLDL诱导鼠源肾小球足细胞脂质蓄积及CXCL16、nephrin蛋白表达的影响,探讨辛伐他汀对足细胞的保护作用机制。第一部分oxLDL诱导小鼠足细胞脂质蓄积模型的建立目的：观察oxLDL诱导小鼠肾小球条件永生性足细胞脂质蓄积情况,旨在建立oxLDL诱导足细胞脂质蓄积模型,为研究足细胞摄取oxLDL的机制及其可能存在的调控因素提供可靠的实验基础。方法：采用体外培养的小鼠肾小球条件永生性足细胞株(MPC5)作为研究对象,在37℃无干扰素-γ的1640完全培养基培养10-14d至其分化成熟后,分别加入梯度浓度为20,40,80,160μg/ml的oxLDL,孵育24h及48h后,油红0染色观察细胞内脂质蓄积情况；比色法检测细胞内总胆固醇浓度。结果：油红0染色可见：与对照组相比,20、40μg/mloxLDL组作用24h及48h,细胞中均未发现明显脂滴；80、160μg/mloxLDL组作用24h有少许脂滴出现,作用48h均发现明显脂滴。细胞内总胆固醇浓度定量分析结果显示,不同浓度oxLDL孵育足细胞24h脂质蓄积不明显,细胞内总胆固醇浓度分别为97.5±29.6μg/ml、101.3±36.4μg/ml、110.6±35.1μg/m1、121.5±26.4ug/ml,与对照组组(90.3±30.1ug/m1)相比,各组细胞内总胆固醇浓度均无显著性差异(P均>0.05)。不同浓度oxLDL孵育足细胞48h,与对照组(102.6±33.5μg/m1)相比,低浓度oxLDL(20、40μg/m1)组无明显变化,细胞内总胆固醇浓度分别为98.4±31.2μg/ml、103.6±31.9μg/m1(P>0.05)；高浓度oxLDL(80及160μg/m1)组,细胞内总胆固醇浓度显著增高,分别为201.0±20.3ug/ml、278.0±35.1μg/m1(P<0.05,P<0.01)；且高浓度oxLDL组孵育48h与24h比较,随着孵育时间延长,细胞内总胆固醇浓度显著增高(P<0.05,P<0.01)。结论：首次用油红染色观察足细胞脂质蓄积,方法简便实用。oxLDL诱导鼠源肾小球足细胞脂质蓄积在一定范围内呈剂量依赖性和时间依赖性。80μg/mloxLDL诱导体外培养小鼠肾小球条件永生足细胞株48h,油红染色可见显著脂质沉积,细胞内胆固醇含量显著增高,成功构建脂质蓄积模型。第二部分不同刺激因素对oxLDL诱导足细胞脂质蓄积和CXCL16表达的影响目的：观察重组小鼠细胞因子IFN-γ、CXCL16单克隆抗体和ADAM10抑制剂对体外培养的小鼠肾小球足细胞摄取oxLDL以及足细胞CXCL16蛋白表达的影响,初步探讨足细胞脂质蓄积的影响因素和调控机制。方法：体外培养小鼠肾小球条件永生性足细胞(MPC5),在37℃无干扰素-γ的1640完全培养基培养10～14d至其分化成熟后,分别加不同处理因素：1.oxLDL(80ug/ml)与不同浓度干扰素-γ(5.0,10.0,20.OU/ml)共同孵育细胞48h和oxLDL(80ug/ml)与干扰素-γ(20.0U/ml)共同孵育细胞24h及48h;2.oxLDL(80ug/ml)与梯度浓度CXCL16单克隆抗体(0.625,1.25,2.5,5.0,10.0ug/ml)共同孵育细胞48h和oxLDL(80ug/ml)与CXCL16抗体(5.0ug/ml)共同孵育细胞24h及48h；3.oxLDL(80ug/ml)与梯度浓度ADMA10抑制剂(0.125,0.25,0.5,1.0,2.0ug/ml)共同孵育细胞48h。另设Ctrl组(不给药),oxLDL组(只加80ug/mloxLDL)。油红染色观察足细胞脂质蓄积情况,比色法检测足细胞内总胆固醇浓度,Westernblot检测足细胞CXCL16的蛋白表达。结果：1.干扰素-γ对oxLDL诱导足细胞脂质蓄积及CXCL16蛋白表达的影响1.1干扰素-γ对oxLDL诱导足细胞脂质蓄积的影响：油红染色结果显示,oxLDL组及oxLDL与各浓度IFN-γ共同孵育组均出现大量脂滴。与Ctrl组相比,oxLDL+各浓度IFN-γ共同孵育组,细胞内总胆固醇含量显著增加,分别为209.2±44.7ug/ml、211.9±22.6ug/ml、273.8±27.1ug/ml(P<0.05；P<0.01)；与oxLDL组比较,oxLDL+IFN-γ(20U/ml)组细胞内总胆固醇含量显著增加(P<0.05)。用oxLDL(80μg/ml)与IFN-γ(20U/ml)共同孵育足细胞24h及48h,细胞内总胆固醇含量分别为174.9±22.1ug/ml及275.3±12.4ug/ml,结果显示随着作用时间延长,细胞内总胆固醇含量显著增加(P<0.01)。此外,oxLDL与IFN-γ共同孵育组,细胞内总胆固醇含量均高于同期oxLDL组(P<0.05)。1.2干扰素-γ对足细胞内CXCL16蛋白表达的影响：Westernblot定量分析结果显示,oxLDL组及oxLDL+各浓度IFN-γ孵育组足细胞内CXCL16蛋白表达显著高于Ctrl组(P<0.05)；与oxLDL组比较,oxLDL+IFN-γ(20U/ml)组CXCL16蛋白表达显著增加(P<0.05)。时效性研究发现,oxLDL组CXCL16的蛋白表达在孵育48h与24h比较无明显变化,不随时间延长而增加；而oxLDL与IFN-γ(20U/ml)共同孵育组,细胞内CXCL16的蛋白水平在48h与24h比较,随作用时间延长而显著增加(P<0.05)。2.CXCL16单克隆抗体对oxLDL诱导足细胞脂质蓄积及CXCL16蛋白表达的影响2.1CXCL16抗体对足细胞内脂质蓄积的影响：油红染色结果显示,与oxLDL组相比,oxLDL与低浓度(0.625μg/ml、1.25μg/ml)CXCL16抗体共同孵育48h油红染色无明显变化；而oxLDL与高浓度(2.5、5.0和10.0μg/ml)CXCL16抗体共同孵育48h,细胞内脂滴均明显减少。细胞内胆固醇检测结果显示,与oxLDL组比较,oxLDL与低浓度(0.625μg/m1、1.25μg/m1)CXCL16抗体共同孵育48h,细胞内总胆固醇含量分别为203.8±24.8ug/ml及174.1±15.1μg/ml,差异无统计学意义(P>0.05)；oxLDL与高浓度(2.5、5.0和10.0μg/m1)CXCL16抗体共同孵育48h组,细胞内总胆固醇含量呈剂量依赖性降低,分别为147.2±15.1ug/ml、100.7±11.4ug/ml及84.1±9.1ug/ml(P<0.05；P<0.01)。2.2CXCL16抗体对足细胞内CXCL16蛋白表达的影响：Westernblot定量检测结果显示,足细胞内CXCL16蛋白表达水平随CXCL16抗体浓度增加呈剂量依赖性降低。与oxLDL组比较,oxLDL与低浓度(0.625μg/ml、1.25μg/ml)CXCL16抗体共同孵育48h组,CXCL16蛋白的表达无显著变化；而oxLDL与高浓度(2.5、5.0和10.0μg/ml)CXCL16抗体共同孵育48h组,细胞内CXCL16蛋白的表达显著降低(P<0.05；P<0.01)。以oxLDL(80μg/ml)与同一浓度(5.0μg/m1)CXCL16抗体共同孵育足细胞24h及48h后,与oxLDL组相比,oxLDL与CXCL16抗体共同孵育组足细胞内CXCL16蛋白表达均显著降低(P<0.05)。3.ADAM10抑制剂对oxLDL诱导足细胞脂质蓄积和CXCL16表达的影响3.1ADAM10抑制剂对细胞内脂质蓄积的影响：油红染色结果显示,与oxLDL组相比,oxLDL分别与0.125μg/m1及0.25μg/mlADAM10抑制剂共同孵育48h,细胞内脂滴无显著变化；oxLDL分别与0.5μg/ml,1.0μg/m1和2.0ug/mlADAM10抑制剂共同孵育48h,细胞内脂滴显著增加。比色法结果显示,与oxLDL组比较,oxLDL与0.125μg/ml及0.25μg/mlADAM10抑制剂共同孵育48h组,细胞内总胆固醇的含量略增高,分别为211.6±12.6μg/m1及227.8±18.3μg/ml,但差异无统计学意义(P>0.05)；oxLDL与0.5μg/ml,1.0μg/ml和2.0ug/mlADAM10抑制剂共同孵育48h组,细胞内总胆固醇的含量显著增加(P<0.05；P<0.01),分别为258.5±26.8ug/ml、284.0±23.2μg/ml、338.3±26.6μg/ml。3.2ADAM10抑制剂对细胞内CXCL16蛋白表达的影响：Westernblot定量分析结果显示,与oxLDL组比较,oxLDL与0.125μg/ml及0.25μg/mlADAM10抑制剂共同孵育组,足细胞内CXCL16蛋白表达略增加,但差异无统计学意义(P>0.05)；oxLDL与0.5μg/ml、1.0μg/ml和2.0μg/mlADAM10抑制剂共同孵育组,足细胞内CXCL16蛋白表达显著增加(P<0.05；P<0.01)。结论：1oxLDL诱导体外培养鼠源肾小球足细胞内CXCL16蛋白表达显著增加,提示oxLDL可能上调足细胞内清道夫受体CXCL16的数量并被过度摄取,导致细胞内胆固醇聚集。2在体外培养条件下,oxLDL与一定浓度的IFN-γ共同孵育足细胞,可使细胞内脂滴增多,总胆固醇含量增高,同时发现足细胞内CXCL16蛋白表达显著增加。提示干扰素-Y通过诱导鼠源肾小球足细胞CXCL16表达上调,促进足细胞对oxLDL的摄取。3在体外培养条件下,oxLDL与一定浓度的CXCL16抗体共同孵育足细胞,可见细胞内脂滴明显减少,总胆固醇含量显著降低,同时发现足细胞内CXCL16蛋白水平显著降低。提示应用CXCL16抗体阻断足细胞CXCL16蛋白表达,可显著降低足细胞对oxLDL的摄取及脂质蓄积。4在体外培养条件下,oxLDL与一定浓度的ADAM10抑制剂共同孵育足细胞,可见细胞内脂滴显著增多,总胆固醇含量显著增加,同时发现足细胞内CXCL16蛋白水平显著增加。提示ADAM10抑制剂可显著增加足细胞CXCL16表达,从而促进足细胞对oxLDL的摄取。第三部分辛伐他汀对oxLDL诱导鼠源肾小球足细胞脂质蓄积干预机制的探讨目的：观察辛伐他汀干预前后oxLDL诱导鼠源肾小球足细胞脂质蓄积及CXCL16、nephrin蛋白表达的变化,探讨其对小鼠肾小球足细胞的保护机制。方法：用80μg/mloxLDL与不同浓度的辛伐他汀(1.0μg/ml、2.0μg/ml)共同孵育小鼠肾小球条件永生性足细胞48h,另设空白对照组(不给药),oxLDL组(只加80μg/mloxLDL),辛伐他汀组(只加1.0μg/ml辛伐他汀)。油红0染色观察细胞内脂质蓄积情况,比色法检测细胞总胆固醇浓度,Westernblot检测足细胞CXCL16/nephrin蛋白的表达。结果：油红0染色可见,与oxLDL组比较,oxLDL+辛伐他汀各组细胞内脂滴明显减少。比色法检测发现,对照组细胞内总胆固醇含量为90.3±30.1μg/ml,辛伐他汀组为93.3±28.6μg/ml,oxLDL组为226.5±21.6ug/ml,oxLDL+辛伐他汀组分别为151.8±6.8μg/ml和135.5±26.9μg/ml。与对照组比较,辛伐他汀组细胞总胆固醇含量无显著变化(P>0.05)；与oxLDL组比较,oxLDL+辛伐他汀各组细胞总胆固醇含量显著降低(P<0.05)。Westernblot检测足细胞CXCL16蛋白的表达水平,与对照组比较,辛伐他汀组CXCL16蛋白表达无改变(P>0.05)；与oxLDL组比较,oxLDL+辛伐他汀各组CXCL16表达显著降低(P<0.05)。nephrin蛋白的表达检测结果显示,与对照组比较,辛伐他汀组nephrin蛋白表达无改变(P>0.05),oxLD组nephrin表达显著降低(P<0.01)；与oxLDL组比较,oxLDL+辛伐他汀各组nephrin表达水平显著增加(P<0.05)。结论：1.经辛伐他汀和oxLDL共同孵育的鼠源足细胞内脂滴明显减少,总胆固醇浓度显著降低,足细胞CXCL16蛋白表达水平亦显著降低。提示辛伐他汀下调oxLDL诱导的鼠源肾小球足细胞CXCL16蛋白表达,减少足细胞吞噬脂质,从而减轻足细胞内脂质蓄积。2.oxLDL诱导鼠源足细胞nephrin蛋白表达显著下降,经辛伐他汀和oxLDL共同孵育的足细胞内nephrin蛋白表达显著增加,提示oxLDL诱导鼠源足细胞nephrin蛋白表达缺失而致足细胞损伤,辛伐他汀能够上调oxLDL诱导的鼠源肾小球足细胞nephrin蛋白表达,对于稳定足细胞功能意义重大。创新和意义：1.首次用油红0染色直观地观察oxLDL诱导鼠源肾小球足细胞内脂质蓄积情况,方法简便实用、经济,可重复性强。oxLDL诱导足细胞脂质蓄积模型的建立,为研究足细胞摄取oxLDL的机制及其调控因素提供可靠的实验基础。2.通过体外细胞培养,证实CXCL16是介导足细胞脂质损伤的关键分子,其表达可被IFN-γ、ADAM10抑制剂等调控,从而影响足细胞摄取脂质,为临床早期防治足细胞脂质氧化损伤提供重要线索。3.首次通过体外实验证实,辛伐他汀干预能够下调oxLDL诱导的鼠源肾小球足细胞CXCL16蛋白表达,减轻足细胞内脂质蓄积；同时上调足细胞nephrin蛋白表达,从而减轻足细胞损伤,初步探讨辛伐他汀对足细胞的保护作用,为临床应用他汀类药物保护肾脏提供参考依据。
【作者】王莉；
【导师】王玉林；
【作者基本信息】山东大学，临床医学，2014，博士
【关键词】氧化低密度脂蛋白；足细胞；脂质蓄积；油红染色法；CXCL16；干扰素-γ；ADAM10；nephrin；辛伐他汀；

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