人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究

【摘要】角膜病患病率高、致盲性强,位居全球致盲原因第二位,目前,全球约有超过1000万的角膜盲患者；同时,角膜病也是我国第二大致盲性眼病,调查显示,我国现有角膜盲患者约100多万。迄今为止,同种异体角膜移植是治疗不可逆性角膜盲最有效的方法。然而,角膜供体的极度匮乏使其应用受到了限制,远远满足不了角膜盲患者的需求；我国每年约有30万患者需行角膜移植术,但因供体角膜有限,每年施行移植手术的患者尚不足4000例(1.3%)。因此,寻找有效的角膜替代物用于角膜移植一直是眼科界研究的热点。目前人工角膜(Keratoprosthesis)是唯一被批准用于临床的角膜替代物,但其生物相容性差、术后并发症多,限制了其在临床的广泛应用。组织工程角膜是近年来研究的热点。其材料来源丰富、生物相容性好,可最大程度的模拟天然角膜结构和功能,有望替代天然角膜用于角膜移植,缓解角膜供体极其匮乏的压力。因此,组织工程角膜的研究具有重大社会意义及显著经济效益。组织工程角膜是通过将种子细胞(角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞)接种于支架材料,经过体外三维培养构建而成。种子细胞和支架材料是组织工程角膜构建的两大关键要素。我们课题组前期研制的脱细胞猪角膜基质(acellularporcinecornealmatrix,APCM),其中的异种细胞及遗传物质被完全脱除,同时胶原及其天然排列结构得到了保留,从而具有良好的透光性、生物相容性以及机械力学性能；组织工程角膜前、后板层的成功构建充分证实APCM是组织工程角膜构建的良好支架材料。种子细胞必须具备较强的增殖能力,能在体外大量扩增。人角膜基质细胞在体外有较强的增殖能力,而上皮细胞和内皮细胞增殖能力有限,尤其是内皮细胞,几乎没有增殖能力,难以在体外培养、扩增,因此寻找新的内皮细胞来源成为亟待解决的问题。目前由于尚未找到理想的内皮细胞来源,大部分有关组织工程角膜构建的研究都是利用增殖能力相对较强的低等动物的角膜内皮细胞或永生化人角膜内皮细胞系等作为内皮细胞的种子细胞,此类内皮细胞构建的组织工程角膜可用于体外实验研究,但是难以满足临床应用的要求。胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)因其所具有的强大增殖能力和分化全能性可作为一种良好的种子细胞来源,为组织工程器官构建提供无限的细胞供给。目前已有人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells,hESCs)诱导分化为心肌细胞、平滑肌细胞、多巴胺神经元及运动神经元等体细胞的报道。然而,迄今为止,国内外尚无hESCs诱导分化成角膜内皮细胞的研究报道。因此如能实现hESCs向角膜内皮细胞的诱导分化,这将为组织工程角膜的构建提供理想的种子细胞来源。因此,本研究探讨了将hESCs定向诱导分化为角膜内皮样细胞(cornealendothelialcell-likecells,CEC-likecells)的可行性,获得了在形态和功能上接近正常角膜内皮细胞的CEC-likecells;将CEC-likecells接种于后板层脱细胞猪角膜支架(posterioracellularporcinecornealmatrix,PAPCM)后弹力层表面构建组织工程角膜内皮植片,体内、体外实验证实构建物具有天然角膜后板层的形态和功能。[目的]角膜脱水状态和透明性的维持很大程度上依赖于角膜内皮细胞的屏障及泵功能。人角膜内皮细胞在体内没有增殖能力,体外培养条件下增殖能力也极其有限。因此,获取大量具有正常角膜内皮细胞功能的细胞有利于角膜内皮细胞基础研究和角膜内皮功能失代偿的治疗。本研究探讨体外诱导人胚胎干细胞经眼周间充质干细胞分化为角膜内皮样细胞的可行性。[方法]通过Transwell共培养体系,将人胚胎干细胞与正在向成纤维细胞转化的人角膜基质细胞共培养5天,分化为眼周间充质干细胞；改为人晶状体上皮细胞源性条件培养基继续培养已向眼周间充质干细胞分化的人胚胎干细胞14天,使其进一步分化为角膜内皮样细胞。利用免疫荧光法检测诱导细胞眼周间充质干细胞标记物CD73和FOXC1以及角膜内皮细胞分化标记物N型钙粘素、FOXC1、PITX2、Na+/K+ATP酶和闭锁小带蛋白-1(zonulaoccluden-1,ZO-1)的表达。流式细胞仪分选CD73表达阳性的眼周间充质干细胞；N型钙粘素/Vimentin双阳性的角膜内皮样细胞。为进一步证明人胚胎干细胞向角膜内皮细胞分化,对分选出的眼周间充质干细胞和角膜内皮样细胞行免疫印迹(Westernblotting)和实时定量聚合酶链式反应(realtime-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测,评估Na+/K+ATP酶在这两种细胞内的表达情况。分选出的角膜内皮样细胞在体外传代培养,扩增后,行免疫荧光检测Na+/K+ATP酶、ZO-1、N型钙粘素及Vimentin表达情况；扩增的角膜内皮细胞经羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CarboxyfluoresceinDiacetateSuccinimidylEster,CFDASE)标记后,接种于脱细胞猪角膜基质后板层构建角膜内皮植片。角膜内皮植片泵功能通过体外尤氏灌流系统及体内动物移植实验进行评估。实验动物术后观察2月,定期行裂隙灯显微镜检查照相、角膜内皮镜、激光共聚焦显微镜及取材病理切片HE染色等检查。[结果]人胚胎干细胞与分化的人角膜基质细胞共培养5天,可见大量梭形细胞从贴壁的拟胚体爬出,表达眼周间充质干细胞标记物CD73和FOXC1;更换为人晶状体上皮细胞源性条件培养基继续培养7天,可见眼周间充质干细胞由梭形逐渐变为多边形,表达人角膜内皮细胞标记物N型钙粘素、FOXC1、PITX2、Na+/K+ATP酶和ZO-1。流式细胞仪成功分选出CD73表达阳性的眼周间充质干细胞及N型钙粘素/Vimentin双阳性的角膜内皮样细胞。Westernblotting和实时定量聚合酶链式反应(realtime-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测表明角膜内皮样细胞较眼周间充质干细胞Na+/K+ATP酶表达明显上调。角膜内皮样细胞在体外传代培养2代,扩增后的细胞Na+/K+ATP酶、ZO-1、N型钙粘素及Vimentin表达阳性。扩增的角膜内皮样细胞经CFDASE标记后,荧光显微镜下见绿色荧光,接种于脱细胞角膜基质后板层成功构建角膜内皮植片。构建物具有正常人角膜后板层类似的形态结构；尤氏灌流系统检测内皮泵功能参数,角膜内皮植片与正常人角膜泵功能参数接近；将构建的角膜内皮植片移植到角膜内皮功能失代偿兔动物模型眼内(实验组),角膜逐渐恢复透明,而单纯移植脱细胞角膜基质后板层的兔眼角膜水肿混浊持续加重(对照组)。角膜内皮镜检查见实验组角膜后表面多边形细胞结构,荧光显微镜下发绿色荧光,HE染色见单层细胞贴附于脱细胞猪角膜后弹力层,而对照组中央角膜后表面未见细胞结构。[结论]人胚胎干细胞诱导分化、流式细胞仪分选获取的角膜内皮样细胞具有正常人角膜内皮细胞的形态结构和内皮泵功能。这为人角膜内皮细胞生物学特性的进一步研究及细胞替代治疗提供了大量细胞来源。
【作者】张凯；
【导师】吴欣怡；
【作者基本信息】山东大学，眼科学，2014，博士
【关键词】人胚胎干细胞；角膜内皮细胞；细胞诱导；内皮细胞移植；

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