慢病毒载体介导的人乳腺癌SKBR-3细胞HER2基因沉默的实验及显像研究

【摘要】目的：研究特异性HER2-shRNA慢病毒载体体外感染乳腺癌细胞SKBR-3后人表皮生长因子受体2（HER2）基因的沉默对肿瘤细胞生物学行为的影响，并通过体内移植瘤实验研究靶向沉默HER2基因后对肿瘤的基因治疗作用以及SPECT显像活体评价RNA干扰（RNAinterference，RNAi）效能的可行性，初步探索SPECT分子影像技术在基因治疗领域的应用前景。方法：①利用本实验室保存的有效HER2-短发夹状（sh）RNA（HER2-shorthairpinRNA，HER2-shRNA）慢病毒表达载体和一条随机序列阴性对照慢病毒载体感染乳腺癌SKBR-3细胞株，通过嘌呤霉素筛选建立稳定表达HER2-小干扰（si）RNA（HER2-smallinterferingRNA，HER2-siRNA）的SKBR-3细胞株及阴性对照细胞株，组成KD组和NC组，并将未感染的SKBR-3细胞作为CON组。②通过RealtimePCR、流式细胞仪及Westernblot检测各组细胞HER2mRNA及蛋白的表达，流式细胞仪、MTT法、Transwell细胞侵袭实验及划痕实验分别检测各组细胞的凋亡、增殖、侵袭及迁移能力。③将各实验组细胞接种于裸鼠，建立荷人乳腺癌裸鼠模型实验（KD）组和阴性对照（NC）组，并以未感染的SKBR-3细胞株裸鼠模型作为空白对照（CON）组，观察各组移植瘤的生长状况，监测瘤体大小，免疫组织化学法测定各实验组离体移植瘤HER2蛋白的表达情况。④通过131I-曲妥珠单克隆抗体（Herceptin）对乳腺癌裸鼠进行SPECT放射免疫显像，追踪观察肿瘤显影情况，比较各实验组T/B（肿瘤/本底）比值。结果：①经嘌呤霉素筛选获得稳定表达有效干扰序列和阴性对照序列的实验细胞株，经流式细胞仪检测，NC组和KD组的荧光表达率均大于80%。②RealtimePCR检测结果显示CON、NC、KD组细胞HER2mRNA的相对含量（HER2/β-actin）分别为1.000、1.081、0.326，KD组与CON和NC组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），KD组的HER2mRNA抑制率为67.4%；此外，应用流式细胞仪测得CON组、NC组和KD组HER2蛋白的表达率分别为（92.40±2.01）%、（92.97±2.44）%、和（55.13±1.65）%，KD组明显低于NC和CON组，差异有显著性（P＜0.01），其HER2蛋白的抑制率为（40.58±0.96）%；Westernblot结果显示CON组和NC组HER2蛋白的相对表达量分别为（0.5481±0.0102）和（0.5494±0.0135），而KD组明显下降，仅为（0.2784±0.0099），差异有统计学意义（P＜0.01）；MTT检测结果显示与CON组和NC组相比，KD组细胞增殖明显减慢（P＜0.01）；KD组细胞早期凋亡为（12.8±0.82）%，显著高于CON组（2.67±0.15）%及NC组（3.27±0.35）%（P＜0.01）；Transwell及细胞划痕实验显示KD组较其他两组的侵袭和迁移能力显著下降。③体内动物实验结果显示与CON组和NC组相比，KD组乳腺癌移植瘤平均瘤体体积、瘤体重量明显减小（P＜0.05）；免疫组化结果亦显示KD组HER2蛋白的表达明显下调；裸鼠经尾静脉注射131I-Herceptin后多次追踪显像，移植瘤部位的放射性随时间的延长逐渐浓聚，各时间点T/B值经组织厚度校正后，KD组均小于CON和NC组。除1h的首次显像外，其余各时间点差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：特异性HER2-shRNA慢病毒载体感染乳腺癌SKBR-3细胞后，可以显著抑制肿瘤细胞株的HER2基因表达及恶性生物学行为；以131I-Herceptin为显像剂的分子影像能在一定程度上反映活体内HER2蛋白的表达情况，为SPECT分子影像技术用于针对HER2靶点的RNA干扰肿瘤生物治疗的疗效评估及监测提供了可行性实验数据。
【作者】钱红；
【导师】石怡珍；
【作者基本信息】苏州大学，影像医学与核医学，2014，硕士
【关键词】Her2/neu；RNAi；乳腺肿瘤；慢病毒；碘放射性同位素；曲妥珠单抗；单光子发射计算机断层成像术；

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